Анализы на основе TR-FRET предоставляют новые экономически эффективные инструменты для скрининга и фармакологической характеристики специфических и селективных модуляторов сигнальных путей JAK/STAT. Этот метод намного проще, быстрее, воспроизводим и надежнее, чем обычные методы, такие как вестерн-блоттинг и ИФА. Никаких этапов промывки не требуется, и реагенты добавляются за один шаг.
Эта платформа иммуноанализа может быть легко применена к другим клеточным сигнальным белкам при условии наличия специфических антител. Для разработки воспроизводимых анализов необходимо использовать надлежащую практику культивирования клеток и установить стандартные рабочие процедуры. Кроме того, необходимо тщательно оптимизировать культуру клеток и условия лечения.
Продемонстрировать процедуру продемонстрирует Женевьева Шатель, ученый из нашей лаборатории. Для начала культивируйте клетки HeLa и A431 в увлажненном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа с использованием DMEM, дополненного 10% FBS. Когда клетки достигнут слияния от 70 до 80%, попробуйте их и либо пройдите, либо используйте для анализов.
Чтобы выполнить анализ, дозируйте 50 микролитров клеток с предварительно оптимизированной плотностью в 96-луночную пластину, обработанную культурой тканей в соответствующей питательной среде, затем инкубируйте их на ночь в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день готовят промежуточные двухкратные и четырехкратные серии разбавления исследуемых соединений путем последовательного разбавления соединения в безсыворочной среде через 12 лунок полипропиленовой 96-луночной пластины. Для стимуляции клеток добавьте 50 микролитров безсыворочной среды, содержащей тренажер в концентрации 2X, и инкубируйте клетки в течение предварительно оптимизированного времени либо при комнатной температуре, либо при 37 градусах.
Для ингибирования клеток добавляют 25 микролитров свободной от сыворотки среды, содержащей ингибитор в концентрации 4X, и инкубируют клетки в течение предварительно оптимизированного времени либо при комнатной температуре, либо при 37 градусах, затем добавляют 25 микролитров безмятежной среды, содержащей стимулятор в концентрации 4X, и инкубируют в течение предварительно оптимизированного времени. Затем, чтобы лизировать клетки, подготовьте 1X дополненный буфер лизиса и добавьте к нему коктейль ингибитора фосфатазы. После тщательного удаления и выбрасывания клеточной культуральной среды сразу добавляют 50 микролитров приготовленного 1X дополненного лизисного буфера и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре при встряхивании с умеренным перемешиванием.
Для обнаружения TR-FRET подготовьте смесь 4X для обнаружения антител в буфере обнаружения 1X, затем подготовьте растворы антител EUAB1 и FRAB2, а также растворы антител EUAB3 и FRAB4 в буфере обнаружения 1X. Наконец, смешайте предварительно разбавленный EUAB1 с предварительно разбавленным FRAB2 для обнаружения фосфопротеина и предварительно разбавленный EUAB3 и предварительно разбавленный FRAB4 для обнаружения общего белка. Затем аккуратно пипетку 15 микролитров клетки лизата с 96-луночной культуральной пластины в лунку из белой малообъемной 384-луночной микропластины.
Затем добавьте 15 микролитров положительного контрольного лизата и 15 микролитров буфера лизиса 1X в качестве отрицательного контроля для разделения пробирных скважин. К скважинам, содержащим 15 микролитров лизата, добавляют пять микролитров соответствующей смеси для обнаружения антител 4X для обнаружения фосфопротеина или общего белка. После покрытия пластины герметиком, высиживайте ее при комнатной температуре в течение одного часа до ночи в зависимости от набора для анализа.
После завершения инкубации снимите герметик клейкой пластины и считайте пластину на считывателе микропластин, совместимом с TR-FRET. Результаты анализов TR-FRET для обнаружения и количественной оценки фосфо-STAT1 с общим STAT1 и фосфо-STAT4 в клетках U266B1 вместе с фосфо-STAT5 с общим STAT5 в ячейках A431 представлены с использованием кривых реакции концентрации. Аналогичным образом, анализы TR-FRET для обнаружения и количественной оценки фосфо-STAT3 и общего STAT3 и фосфо-STAT6 и общего STAT6 в клетках HeLa представлены с использованием кривых реакции концентрации.
В целом, все анализы показали надежные сигналы TR-FRET, широкие динамические диапазоны, низкое изменение коэффициента между скважинами и приемлемое отношение сигнала к фону. Лечение клеток активаторами JAK, интерфероном альфа-2B и IL-4 и EGF показало ожидаемое концентрационно-зависимое увеличение фосфорилирования STAT при специфических остатках тирозина, в то время как соответствующие общие белки STAT оставались стабильными. Как ингибитор JAK, так и эрлотиниб ингибировали соответствующие уровни фосфо-СТАТ в зависимости от концентрации.
Результаты стимуляции фосфо-STAT4 интерфероном альфа-2B в клеточной линии суспензии или стимуляции фосфо-STAT6 IL-4 в клеточной линии адгезии с использованием протокола одной пластины соответствовали результатам, полученным с использованием протокола двух пластин, что свидетельствует об успешной адаптации протокола переноса двух пластин к протоколу однопластинки «все в одной скважине». Результаты исследования внутрипластинчатой изменчивости для анализа фосфо-STAT1 с использованием клеточной линии суспензии и анализа фосфо-STAT3 с использованием клеточной линии адгезии демонстрируют надежность этих анализов фосфо-STAT для применений HTS. Важно дополнить буфер лизиса коктейлем ингибитора фосфатазы, чтобы предотвратить дефосфорилирование фосфорилированных белков из активной фосфатазы, присутствующей во всем клеточном экстракте.
