Протокол предусматривает простую процедуру, позволяющую сделать эксперименты FRET с помощью сенсибилизированных выбросов более воспроизводимыми и сопоставимыми. Основным преимуществом FRET являются измерения в режиме реального времени, так что динамические процессы могут быть решены. Для лазерной регулировки с помощью пропускающего фотоумножителя поместите под микроскоп восьмилуночный слайд, содержащий трансфектированные протопласты.
После выбора пустого колодца выберите режим сканирования линии и вид гистограммы, уменьшите интенсивность лазера до минимума и отрегулируйте коэффициент усиления детектора до обнаруживаемого фонового шума. Далее увеличивайте интенсивность лазера с шагом 0,5% при записи соответствующего сигнала. Для лазерной регулировки с помощью отражающего режима выберите пустой колодец, затем примените фильтр отражения.
Включите режим отражения и убедитесь, что диапазон длин волн детектора покрывает длину волны лазера. Выберите режим линейного сканирования и вид гистограммы, уменьшите интенсивность лазера до минимума и отрегулируйте усиление детектора до обнаруживаемого фонового шума. Затем переместите объектив в самое низкое положение, прежде чем переместить его обратно вверх, пока не будет видно отражение крышки, затем увеличьте интенсивность лазера с шагом 0,5% при записи соответствующего сигнала.
Для оценки данных сведите в таблицу и отсортируйте данные по интенсивности сигнала, затем постройте график интенсивности сигнала относительной мощности лазера и выберите интенсивность лазера, приводящую к аналогичной интенсивности сигнала. Для регулировки фотоумножителей выберите пустую скважину и примените фильтр отражения, переключитесь в режим отражения и убедитесь, что диапазон длин волн детектора покрывает длину волны лазера. Выберите режим линейного сканирования и вид гистограммы, уменьшите коэффициент усиления детектора до половины максимального и отрегулируйте интенсивность лазера до обнаруживаемого фонового шума.
Затем переместите объектив в самое низкое положение, прежде чем переместить его обратно вверх, пока не будет видно отражение крышки, затем увеличьте коэффициент усиления детектора с шагом от 50 до 100 вольт и запишите соответствующий сигнал. Для оценки данных постройте график интенсивности по отношению к усилению детектора для каждого детектора, а затем выберите отдельный коэффициент усиления детектора для получения аналогичной чувствительности. Для получения изображения выберите соответствующие фильтры или дихроичные зеркала и используйте одно и то же дихроичное зеркало для всех каналов, чтобы включить построчное сканирование, затем выберите объект погружения в воду для визуализации живых клеток и выберите 12- или 16-битное сканирование с умеренной скоростью сканирования.
Далее определяют диапазон обнаружения предпочтительно от 470 до 510 нанометров для обнаружения донора и от 530 до 600 нанометров для акцепторного обнаружения в случае пары FRET усиленного голубого флуоресцентного белка или ECFP и усиленного желтого флуоресцентного белка или EYFP. После применения детектора и настроек лазера, как показано ранее, при необходимости пересмотрите интенсивность лазера на основе полученной таблицы мощности лазера. Убедитесь, что отношение сигнал/шум охватывает весь динамический диапазон детекторов.
После тонкой настройки с диаметром точечного отверстия, сохраняя при этом интенсивность лазера и постоянное усиление детектора, выполните измерения FRET, получая изображения не менее 20 ячеек. Чтобы определить перекрестные коллизионные коррекции, выполните измерения FRET с клетками, экспрессирующими только донорский флуорофор, и только с клетками, экспрессирующими акцепторный флуорофор. Для калибровки измерений выполните измерения FRET с клетками, экспрессирующими слияние донорского акцептора.
Для оценки данных получите линейные профили ячеек, гарантируя, что каждый профиль содержит не более одной ячейки. Сохраните профили в виде текстовых файлов. Затем, используя опцию импорта текстовых файлов в разделе данных, импортируйте текстовые файлы в электронную таблицу.
Затем считайте максимальные значения, применив функцию max, затем перечислите полученные значения в таблице, имеющей столбец для идентификатора выбросов донора, излучения FRET IF, акцептора излучения IA и по крайней мере четырех наборов данных, только донор, только акцептор, слияние донор-акцептор и измерение. Лазерная регулировка выявила линейное увеличение излучения с увеличением интенсивности лазера. Как показал более крутой склон, выброс 514-нанометровой линии был намного выше, чем выброс 458-нанометровой линии.
Изменение коэффициента усиления детектора при постоянной мощности лазера выявило экспоненциальное поведение для обоих анализируемых детекторов. Несоответствие и спектральное кровотечение донора и акцептора, проанализированных с рекомбинантными очищенными белками и проанализированных с клетками, экспрессирующими эти белки, показывает, что невозможно опустить определение спектрального кровотечения в живых клетках, вероятно, вызванного клеточными пигментами. Эффективность FRET между мечеными вакуолярными субъединицами ATPA, VHA AECFP и VHA AEYFP снижалась с увеличением интенсивности сигнала.
Напротив, взаимодействие между VHA E1 ECFP и VHA CEYFP не зависело от интенсивности сигнала. Выбор соответствующих оптических компонентов имеет решающее значение для обнаружения донора и акцептора. Этот протокол также может быть применен для ратиометрических датчиков в живых клетках для повышения воспроизводимости в этих экспериментах.
