Здесь мы продемонстрировали протокол получения и сохранения хороших и жизнеспособных клеток для использования терапевтических этапов, таких как инфузия плюрипотентных мезенхимальных клеток. Основным преимуществом этого является то, что с помощью этой методики мы можем получить жизнеспособный клеточный объем по сравнению со временем, полученным на этапе выделения клеток из собранной ткани. Этот метод может быть распространен на все заболевания или состояния, где применяется гетерогенная медицина и клеточная терапия.
Этот метод также может быть применен для тестирования цитогеномной стабильности в таких областях, как тестирование на наркотики, где могут поощряться долгосрочные клеточные культуры. Всякий раз, когда вы манипулируете живыми клетками, будьте спокойны и уверены в себе. Будьте предельно осторожны при сепсисе и будьте постоянно бдительны глазами ученого, чтобы наблюдать за любыми невзгодами и принимать правильные решения.
Начните с взвешивания сумки и измерения температуры с помощью цифрового бесконтактного инфракрасного клинического термометра. Оставьте мешок на пять минут внутри ламинарной камеры потока, чтобы высадить более жирные слои и отделить ткань, содержащую клетки. Введите 100 миллилитров DPBS с кальцием в переносной мешок и перемешайте его руками.
Дайте ему постоять пять минут. Затем используйте 60-миллилитровый шприц, прикрепленный к адаптеру мешка, чтобы выбросить большую часть базальной жидкости, которая выпадает в осадок. Повторите этот процесс два раза.
Добавьте в пакет 100 миллилитров раствора для пищеварения и оставьте при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут при медленном перемешивании. Затем переложите все содержимое пакета в четыре конические трубки по 50 миллилитров и центрифугируйте их при 400G в течение 10 минут при 22 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и добавьте 5 миллилитров DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 20% фетальной бычьей сывороткой в клеточную гранулу.
Смешайте свежий раствор 10 микролитров трипан-синего под 0,05% в дистиллированной воде с 10 микролитрами клеточной суспензии в течение пяти минут. Используйте инвертированный световой микроскоп с 20-кратным увеличением и подсчитывайте жизнеспособные клетки в камере подсчета клеток Нойбауэра. Суспендировать клеточную гранулу в криозащитной среде в концентрации 1 млн клеток на миллилитр.
Затем поместите 1 миллилитр этой смеси в криопузырьки. Используйте морозильный контейнер со скоростью охлаждения 1 градус Цельсия в минуту и храните при 80 градусах Цельсия в течение одного года. Через год храните его в стандартных кассетных коробках, погруженных в фазу паров жидкого азота.
Данные о различных этапах процедуры от девяти пациентов представлены в этой таблице. В соответствии с начальным клеточным выходом определяли переменный объем клеток для каждого образца. 1 миллилитр образцов с более высоким клеточным выходом, 1,1 миллилитра для образцов с промежуточным клеточным выходом и 2 миллилитра на образцы с более низким клеточным выходом.
Клеточный выход перед прохождением один широко варьировался даже тогда, когда наблюдалось такое же слияние до трипсинизации. Поэтому здесь клетки, возможно, выросли слоями. На репрезентативном изображении показаны пластически адгезивные мезенхимальные АЦДК при первом прохождении после выделения при световой микроскопии.
Клетки демонстрируют адгезию к пластической и фибробластоподобной морфологии. Жизнеспособные клетки, подсчитанные в камере Нойбауэра в трипановом синем анализе, показаны здесь. Данные проточной цитометрии шести пациентов представлены в этой таблице.
Из этих CD45 отрицательных клеток определяли процент ADSC с различными комбинациями маркеров стволовых клеток. Репрезентативные изображения показывают субпопуляцию клеток, положительных на маркеры, связанные со стволовыми клетками, в SVF девятого случая после восьми месяцев криоконсервации. Здесь R1 представляет собой общую клеточную область, проанализированную на диаграмме прямого рассеяния против бокового рассеяния.
А R2 — это отрицательная область CD45. Популяции CD73, CD90 и CD105 являются положительными в этом регионе. Дифференцировка ADSC в хондроцитах, остеоцитах и адипоцитах показана здесь.
Во время этой процедуры не забывайте медленно помешивать, желательно руками, оставляя при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы наблюдать спайки и волдыри. Поддерживайте температуру в рабочем помещении около 25 градусов по Цельсию и избегайте теплового удара при гораздо более высоких температурах. Методика, которую мы показали здесь, может быть использована для успешного выделения плюрипотентных мезенхимальных клеток из других тканей.
