Применение флуоресцентной гибридизации in situ, называемой FISH, к стратификации генетического риска при множественной миеломе имеет важное значение. Критической частью отчетов FISH являются не все ядерные клетки, а клональные плазматические клетки, специально очищенные или идентифицированные путем сортировки с помощью магнитных шариков против CD138 или маркировки цитоплазматической каппой или лямбда-иммуноглобулином с легкой цепью с помощью тестирования FISH, называемого cIg FISH. Межфазный FISH после сортировки плазматических клеток или cIg FISH оказывается значимым в диагностике множественной миеломы, из-за относительно меньшей доли плазматических клеток в костном мозге.
Однако эти методы имеют некоторые недостатки, включая сложные процессы, высокие требования к образцам и высокие экспериментальные затраты. Плазматические клетки могут быстро располагаться в мазке костного мозга. Исходя из этого, мы используем мазок костного мозга FISH для обнаружения множественных клеток миеломы.
Это исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по этике больницы Чжуннань Уханьского университета. Образцы были собраны у пациента с множественной миеломой в отделении гематологии больницы Чжуннань Уханьского университета Китая. Поместите первые 0,2 миллилитра раствора костного мозга на чистую одноразовую стеклянную горку, распределите мазки костного мозга до равномерной толщины и острых хвостов, быстро удалив костный мозг, а затем высушите его естественным путем.
Накройте пленки костного мозга одним миллилитром раствора Райта-Гимса в течение примерно 10 секунд при комнатной температуре. Добавьте один миллилитр фосфатного буфера к слайдам, чтобы предотвратить высыхание или стекание раствора красителя с горок. Аккуратно перемешайте раствор красителя и выдерживайте его в течение 15 минут при комнатной температуре.
Промойте горки чистой водой и высушите ее на воздухе при комнатной температуре. Используйте прямую световую микроскопию для выявления злокачественных плазматических клеток, плазматические клетки должны быть хорошо диспергированы. Теперь то, что мы видим в поле, - это плазматические клетки, которые довольно рассеяны.
Это типичная бинуклеарная ядерная плазматическая клетка. Накройте гибридизированную область фиксирующим раствором на 10 минут, чтобы обесцвечить и зафиксировать плазматические клетки. Промойте горку деионизированной водой и высушите ее на воздухе при комнатной температуре.
Разогрейте банку, содержащую два раза буфер SSC, до 56 градусов Цельсия на водяной бане. Вымойте подготовленный мазок костного мозга в предварительно разогретом два раза буфере SSC в течение 10 минут с последующим погружением в деионизированную воду комнатной температуры. Обезвоживать мазок в градиенте этанола 70%85% и 100% этаноле каждый в течение одной минуты.
Высушите мазок на воздухе в течение 10 минут. Сначала добавьте TP53 на центромеру смеси зонда хромосомы 17 в область гибридизации и накройте ее покровным скользящим прессом осторожно мелкоконечным пинцетом, чтобы удалить пузырьки воздуха снизу. Запечатайте все стороны крышки резиновым цементом, чтобы обеспечить хорошую герметичность.
После затвердевания резинового цемента затвор помещали на автоматическую машину FISH, денатурацию выполняли при 78 градусах Цельсия в течение пяти минут с последующей гибридизацией при 37 градусах Цельсия в течение ночи. Поднимите слайд с машины FISH. Используйте тонкий заостренный пинцет, чтобы аккуратно удалить резиновый цемент.
Погрузите слайд в два раза SSC при комнатной температуре примерно на одну или две минуты, чтобы смыть крышку. Мойте горку в буфере предварительного нагрева при температуре 68 градусов Цельсия на водяной бане в течение двух минут. Мойте горки два раза SSC на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия в течение одной минуты.
Установите прямо в темноте, чтобы тщательно высохнуть в течение 10 минут на 10 микролитров DAPI в гибридизированную область, накройте крышкой. Просмотрите гибридизированный слайд с помощью подходящего фильтра, установленного на флуоресцентном микроскопе, используйте монохроматический синий флуорофорный оптический фильтр для наблюдения за интенсивностью флуоресценции ядра клетки. Делайте снимки клеточного ядра под набором фильтров DAPI.
CEP17 был помечен зеленой флуоресценцией. Используйте спектр зеленого флуорофорного оптического фильтра для наблюдения за местоположением CEP17. Возьмите изображение сигналов CEP17 под зеленым фильтром.
Ген TP53 был помечен оранжевой флуоресценцией. Используйте спектр оранжевого флуорофорного оптического фильтра для наблюдения TP53, возьмите изображение сигналов TP53 под набор, объедините эти три изображения в целое и изучите на наличие числовых аномалий. В нормальной межфазной клетке внутри ядра наблюдаются два оранжевых и два зеленых сигнала с синей флуоресценцией, указывающей на одну пару нормальных хромосом 17.
Результаты показали морфологию и генетику костного мозга у пациента с множественной миеломой. Рисунок А показал, что 15% плазматических клеток в мазке костного мозга были обнаружены более крупными и темными и ядерными наряду с большим количеством цитоплазмы, чем обычно. На рисунке B показано изображение серой шкалы представителя ядерной плазматической клетки в мазке костного мозга.
На рисунке C показаны четыре оранжевых и четыре зеленых сигнала в одном межфазном ядре плазматической клетки, предполагающие, что четыре копии хромосомы 17 были локализованы в ядре. Рисунок D показал, что аномальная хромосомная кариограмма этого пациента подтвердила две пары хромосом 17 в одном ядре. Мазки костного мозга получить гораздо легче, чем антикоагулянтные образцы костного мозга, потому что получение антикоагулянтного костного мозга требует сложных процедур для получения ядра.
Соответственно, мы установили убедительный метод мазка костного мозга FISH для выявления множественных клеток миеломы.
