Этот протокол направлен на получение высококачественных специфических РНК типов клеток из небольшого количества клеток в сложной ткани без сортировки клеток. Он использует недавно доступную модель мыши, которая позволяет исследователям изолировать рибосомные связанные РНК с помощью GLP pull down. Метод также подходит для выделения рибосомных связанных РНК из любых EGFP-экспрессирующих клеток.
Для начала добавьте два миллилитра рабочего буфера гомогенизации ледяного холода в комплект измельчителя стеклянной ткани. Быстро поместите замороженный образец в мясорубку и гомогенизируйте ткань 30 ударами по льду с помощью рыхлого пестика. переложить гомогенат на двухмиллилитровую трубку с круглым дном и центрифугу по 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем перенесите супернатант в новую двухмиллилитровую трубку, не нарушая гранулу, резервируя 100 микролитров в качестве входных данных. Инкубируйте супернатант с антителом против GFP при четырех градусах Цельсия на конце торцевого ротатора в течение ночи. Переложите смесь гомогената и антител в новую двухмиллилитровую трубку с круглым дном, содержащую промытые белковые шарики g, и инкубировали четыре градуса Цельсия на ротаторе при 24 об/мин в течение двух часов.
Отделите магнитные шарики от супернатанта с помощью магнитной стойки. Сохраните супернатант как отрицательную фракцию, которая содержит РНК в отрицательных клетках EGFP и РНК в положительных клетках EGFP, которые не связаны с рибосомами. Добавьте один миллилитр буфера для промывки высокой соли в бусины и ненадолго вихрьте трубку, чтобы промыть бусины.
Затем поместите трубку в магнитную стойку. Удалите буфер промывки и повторите шаги промывки еще два раза, чтобы получить комплекс РНК рибосомы шариков из EGFP-положительных клеток. Инкубируйте шарики с 50 микролитрами экстракционного буфера из комплекта изоляции РНК в ThermoMixer в течение 30 минут, чтобы освободить РНК из шариков.
Отделите бусины с помощью магнитной стойки и перенесите супернатант в трубку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте пробирку по 3000 г в течение двух минут. Затем пипетку супернатанта в новую трубку объемом 1,5 миллилитра.
Чтобы предварительно кондиционировать колонну очистки РНК, пипетку 250 микролитров кондиционирующего буфера на очистительную колонну и инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем центрифугируют колонну при 16 000 г в течение одной минуты. Пипетка равного объема 70% этанола в клеточный экстракт и хорошо перемешивается путем пипетки.
Пипетка до 200 микролитров смеси в предварительно кондиционированную колонку очистки РНК. Для уменьшения потерь образцов не заполняйте колонну более чем на 80% ее емкости. Повторяйте этот шаг несколько раз, пока все РНК не будут собраны в один столбец каждой фракции.
Центрифугируют колонну в течение двух минут, чтобы связать РНК с мембраной в колонке. Затем продолжайте центрифугирование в течение 30 секунд. Отбросьте поток и пипетку 100 микролитров промывочного буфера один в колонну.
Центрифугируйте в течение одной минуты, затем отбросьте поток насквозь. Пипетка 75 микролитров раствора ДНК смешивается непосредственно с мембраной колонки очистки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
Затем пипетка 40 микролитров промывочного буфера один в колонну и центрифугу еще на 30 секунд. Отбросьте поток. Пипетка 100 микролитров промывки буфера два в колонну и центрифугу по 8 000 г в течение одной минуты.
Отбросьте поток. Купить ПЭТ 100 микролитров промывочного буфера два в колонну и центрифугу по 16 000 г в течение двух минут. Отбросьте поток и повторно центрифугируйте ту же колонну по 16 000 г в течение одной минуты, чтобы удалить все следы промывочного буфера.
Перенесите колонну на новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. пипетка 12 микролитров рваной воды непосредственно на мембрану очистительной колонны, гарантируя, что наконечник пипетки не коснется мембраны. Инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты и центрифугировать по 1000 г в течение одной минуты.
Затем при 16 000 G в течение одной минуты элюировать РНК. Используйте биоанализатор для оценки качества и количества экстрагированной РНК. Храните РНК в морозильной камере на 80 градусов или отправляйте на дальнейший анализ.
Мышам, несущим оба генно-инженерных аллеля генов, Gli1-CreERT2 и NuTRAP, нам вводят тамоксифен один раз в день, через день для трех инъекций. Иммунофлуоресцентный анализ собранных тканей показывает, что EGFP экспрессировался в интерстициальных клетках в яичках. EGFP также был обнаружен в капсульных клетках надпочечников у мышей Gli1-CreERT2, NuTRAP.
У мышей Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP Популяция EGFP-положительных клеток находится во внешней коре надпочечников под капсулой, подтверждая экспрессию EGFP предварительно экспрессирующих клеток. После экстракции специфических РНК клеточного типа экстрагированную РНК отправляли на анализ микрочипов. Результаты показали, что около 3000 генов были обогащены положительной фракцией, по сравнению с генами в отрицательной фракции, тогда как около 4000 генов были обогащены отрицательной фракцией.
Среди дифференциально экспрессированных генов клетки Лейдига гены Hsd11b1 и Hsd3b6 были обогащены положительной фракцией. В отрицательной фракции были обогащены связанные с клетками Сертоли гены Desert Hedgehog и Gstm6. Только несколько дифференциально экспрессированных генов были идентифицированы при сравнении отрицательной фракции с входом.
Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени использовалась для подтверждения экспрессии ключевых генов в положительных и отрицательных фракциях. Подобно тому, что было обнаружено в анализе микрочипов, стероидогенные ферменты 3-бета-гидроксистероиддегидрогеназа и фермент расщепления боковой цепи холестерина были обогащены положительной фракцией. Между тем, клеточный маркер Сертоли SRY бокс транскрипционный фактор девять и маркер зародышевых клеток синаптонемального комплексного белка три были обогащены отрицательной фракцией.
При попытке этого протокола важно приготовить свежий рабочий буфер гомогенизации Добавить DTT, циклогексимид рекомбинантную рибонуклеазу и коктейль ингибитора протеиназы в раствор гомогенизации только перед использованием. Также важно приготовить свежие буферы с низким содержанием соли и буферы для промывки с высоким содержанием соли перед использованием.
