Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетики, такие как, сколько хроматических модификаций регулируются определенным образом типа клетки вместе с геномами. Основным преимуществом этой техники является то, что мы можем изолировать хроматин от целевых клеток, а затем следовать типичным цыган вниз по течению. Таким образом, этот метод может обеспечить понимание нейрона конкретных триминцил, лисинк 4, opisoncilly.
Он также может быть применен к другим модификации гистон, другие типы клеток, а затем другие модели организмов. Демонстрацией процедуры будет Мари Мито, техник из моей лаборатории. Для начала используйте тонкие весенние ножницы, чтобы вскрыть ткани интерес на мелкие кусочки.
Добавьте фрагменты тканей в чистый контейнер, наполненный жидким азотом. Затем перенесите фрагменты тканей в две миллилитровые трубки, наполненные жидким азотом. Храните трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут с крышкой открытой для испарения жидкого азота.
Поместите трубки, содержащие образцы тканей, на охлажденную металлическую ледяную стойку. Затем поместите металлическую пулю в 1,5 миллилитровую трубку и охладите ее жидким азотом. Поместите охлажденную металлическую пулю в одну из пробных трубок.
Закройте крышку и установите трубку в трубку держателя криогенной шлифовальной машины. Немедленно окуните собранный держатель трубки в жидкий азот на одну минуту. Вставьте замороженный держатель трубки во внешнюю кассету криогенной шлифовальной машины.
И встряхните его энергично в течение 30 секунд, 60 раз. После этого разберите криогенную мясорубку, удалите металлическую пулю. И поместите трубку в предварительно охлажденный кулер образца.
Храните кулер при отрицательном 20 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Затем добавьте 900 микролитров 1%формальдегида в трубку и пипетку для смешивания. Перенесите подвеску на новую двухми миллилитровую трубку с 900 микролитров 1%формальдегида.
Затем зафиксьте подвеску на 10 минут с нежным вращением при 23 градусах по Цельсию. Чтобы остановить реакцию фиксации, добавьте в трубку 100 микролитров 2,5 молярного глицина. И центрифуга при 3000 раз гравитации в течение пяти минут при четырех градусах цельсия.
После этого, отказаться от супер супернатанта. Добавить один миллилитр PBS в трубку и вихрь, чтобы смешать. Центрифуга при 3000 раз гравитации в течение пяти минут при четырех градусах цельсия.
Повторите этот шаг мытья, еще два раза. Затем добавьте 500 микролитров буфера лиза один к гранулам и пипетки для смешивания. Центрифуга трубки в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта.
Добавьте один миллилитр буфера лиза два гранулы и вихрь, чтобы смешать. Затем центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отбросить супернатант. После этого добавьте 800 микролитров буфера анализа радиодефицита с ингибитором протеазы в гранулы и пипетку для смешивания.
Центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта. Затем добавьте в гранулы 500 микролитров буфера RIPA с ингибитором протеазы. Затем центрифуга подвески в течение пяти минут при 3000 раз тяжести при четырех градусах по Цельсию и отбросить супернатант.
Добавьте один миллилитр буфера RIPA с коктейлем ингибитора протеазы. Сразу же после добавления буфера RIPA с коктейлем ингибитор протеазы, перенесите лизат в трубку sonicator. И поместите трубку на ультразвуковой.
Используя настройки, изложенные в текстовом протоколе, свяйте хроматин. Затем перенесите образец в 1,5 миллилитровую белковую трубку с низким связывающим. И центрифугать его в течение пяти минут при 20 000 раз гравитации при четырех градусах Цельсия.
Соберите супернатант из образца и перенесите его в новую белковую трубку с низким связывающим. В этом протоколе было введено и продемонстрировано тандемное секвенирование иммунопреципиентации хроматина. Во время процедуры качество ДНК проверялось на нескольких этапах.
Сразу же после звуковой связи, стрижка ДНК была изолирована и протестирована с помощью микрофлюидной электрофорезной машины. После использования анти-FLAG антитела и анти-H3K3me3 антитела для выполнения сродства очистки качества ДНК была проверена снова. Специфика иммунной очистки ДНК на H2B-FLAG была подтверждена отрицательными контрольных пробами.
Где было обнаружено незначительное количество ДНК. Далее в протоколе было проверено качество библиотеки секвенирования. Успешные ChIP и T-ChIP были улики с помощью анализа обогащения с использованием грунтовки ориентации промоутер области гена GAPDH.
Получены репрезентативные перераспределения по трем генам нейронов. И обогащение читает на пяти основных концах генов нейроном T-ChIP искать на весь мозг T-ChIP искать наблюдалось. После стабилизации, этот метод прокладывает путь для исследователей в эпигенетической области для изучения типа клеток конкретных модификаций гистона в целом широко в нейронах у мышей.
Не забывайте, что работа с формальдегидом может быть чрезвычайно опасной и принимать меры предосторожности, такие как ношение резиновой одежды и очков, всегда следует принимать при выполнении этой процедуры.
