Визуализация биологических макромолекул является критическим навыком для студентов и специалистов в области биологических наук. В этом протоколе мы демонстрируем, как моделировать активный сайт фермента глюкокиназы с помощью четырех свободно доступных программ для молекулярного моделирования. В этом учебнике освещаются несколько шагов протокола для каждой программы, которые включают в себя выбор связанных лигандов и использование лигандов для отображения аминокислот и молекул воды в пяти ангстремах.
Вспомогательная информация этой рукописи содержит специальное видео для каждой программы, в котором подробно описаны все этапы протокола с дальнейшим объяснением. Структура будет моделировать PDBID. 3ФГУ представляет собой каталитический комплекс фермента глюкокиназы.
Активный центр фермента связан с двумя его субстратами, бета-D-глюкозой, которая дала идентификатор BGC и ион магния, MG. Кроме того, этот аналог субстрата, фосфоаминофосфорная кислота, аденилатный эфир, ANP связывается с активным центром глюкокиназы. Этот негидролизуемый аналог аденозинтрифосфата АТФ предотвращает реакцию фосфорилирования, которая захватывает активный комплекс сайта прекатализа. Интерфейс программы моделирования UCSF ChimeraX содержит выпадающие меню, панель инструментов, средство просмотра структуры и командную строку.
Мы начнем протокол с шага 1.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта. Чтобы выбрать лиганды, нажмите контрольный сдвиг и нажмите на любой атом или связь в каждом из трех лигандов. Нажимайте клавишу со стрелкой вверх, пока все три лиганда не будут выделены зеленым свечением.
Определите выбор для будущего использования, щелкнув в раскрывающемся меню, выберите определить селектор, введите лиганды для имени выделения и нажмите кнопку «ОК». Опять же, с помощью меню выбора выберите зону. Переключите его на остатки и убедитесь, что установлен верхний флажок.
Нажмите кнопку ОК. Обратите внимание, что части мультфильма в пределах пяти ангстрем этих лигандов выделены. Чтобы отобразить боковые цепи в виде палочек и показать активный сайт молекул воды, используйте меню действий атомных связей, чтобы показать их.
Или включите их с помощью этих кнопок здесь. Чтобы очистить выделенную область, щелкните в любом месте пустого пространства. Конечным результатом этого протокола должна быть модель с активным центром белка и лигандами, показанными в виде палочек, окрашенных контрастным образом.
Ключевые полярно-связывающие взаимодействия показаны пунктирными линиями, а некоторые остатки, образующие контакты, помечены. Интерфейс iCn3D содержит выпадающие меню, средство просмотра структуры и журнал команд. В этом представлении отображаются всплывающие меню выборочных наборов, последовательностей и аннотаций, которые появляются, когда пользователь выполняет необходимые команды.
Мы начнем протокол на шаге 2.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта. Чтобы выбрать лиганды, используйте раскрывающееся меню выбора и нажмите выбрать на 3D, убедитесь, что остаток отмечен. Удерживая кнопку alt на ПК или кнопку опции на Mac, нажмите на первый лиганд.
Затем нажмите control и нажмите на оставшиеся два лигана, чтобы добавить их в выбор. Сохраните выделенный фрагмент с помощью раскрывающегося меню, нажмите кнопку выбрать, сохраните выделение, введите имя и нажмите кнопку сохранить. Появится всплывающее меню выбора наборов с тремя выбранными лигандами.
Теперь выделите остатки в пределах пяти ангстрем лигандов. Используйте раскрывающееся меню, выберите по расстоянию. Во всплывающем меню измените копье второго элемента с радиусом на пять ангстрем, набрав блок, нажмите кнопку Отображение.
Затем закройте окно, щелкнув значок X в правом верхнем углу. Сохраните пять активных сайтов angstrom, щелкнув раскрывающееся меню, выберите Сохранить выделенную область и с помощью клавиатуры введите имя. Затем нажмите кнопку Сохранить.
Теперь создайте новую выделенную область, объединяющую два набора. Их можно комбинировать во всплывающем меню выбора наборов. На ПК можно нажать на два набора или на Mac щелкнуть командой.
Снова щелкните раскрывающееся меню, выберите Сохранить выделенную область, введите новое имя, а затем нажмите кнопку Сохранить. Чтобы показать взаимодействия, такие как водородные связи, используйте меню анализа и выберите взаимодействия. Здесь нас будут интересовать только водородные связи и соляные мосты.
Поэтому мы снимем все остальные. Мы выберем три лиганда. А для второго набора остатки в пределах пяти ангстрем.
Щелкните Взаимодействия с 3D-дисплеем и закройте окно. Это показывает некоторые из остатков, которые взаимодействуют, но не показывает весь активный сайт ангстрема. Чтобы отобразить это, снова используйте меню выбора наборов.
Нажмите на пять полных ангстрем, а затем в выпадающем меню нажмите стиль боковых цепочек, палок. Чтобы применить раскраску CPK, нажмите на раскрывающееся меню цвета и нажмите атом. Конечным результатом протокола должна быть модель, которая выглядит так с активным сайтом белка и лигандом, показанным в виде палочек, окрашенных контрастным образом.
Важные взаимодействия привязки показаны пунктирными линиями, и все остатки в одном из выделений, созданных во время протокола, помечаются. Интерфейс Jmol содержит выпадающие меню, панель инструментов, средство просмотра структуры, всплывающее меню и консоль Jmol, содержащую командную строку. Мы начинаем протокол Jmol на шаге 3.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта.
Консоль Jmol — лучший способ выбора остатков в пределах пяти ангстрем. Введите эту команду, чтобы выбрать остатки в пределах пяти ангстрем из трех лигандов. Выбрано 193 атома, но они не представляют собой полные аминокислотные остатки.
Чтобы выбрать их, используйте введенную команду, выберите внутри(группа, выбрано) и нажмите клавишу ВВОД. Обратите внимание на появление дополнительных ореолов выделения. Чтобы отобразить эти остатки в виде палочек, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы открыть всплывающее меню, наведите указатель мыши на стиль, схему, а затем нажмите «Палочки».
Обратите внимание, что здесь все еще есть некоторые пустые ореолы. Это молекулы воды в активном центре. Чтобы выбрать только молекулы воды, мы можем повторно выполнить эту команду, а затем изменить ее.
Щелкните внутри консоли, затем с помощью клавиш со стрелками вверх найдите эту команду и нажмите клавишу ВВОД, чтобы повторно выполнить ее. Чтобы отобразить молекулы воды в виде атомов, мы хотим удалить выделение лиганда и белка. Для этого мы введем две команды.
Наши лиганы считаются гетерогруппами, но вода также считается одной. Таким образом, в рамках этой команды нам нужно определить, что мы не удаляем воду. Нажмите enter и теперь выбираются только молекулы воды.
Нажмите на раскрывающееся меню, наведите курсор на атом и выберите 20% радиуса ван-дер-Ваальса. Зеленый ион магния по-прежнему показан в виде палочек. Чаще всего ионы показаны в виде сфер.
Щелкните в консоли Jmol и введите select MG, а затем заполните пробел 50%Лиганды внутри цепочек окрашены одинаково. Чтобы отличить их друг от друга, полезно перекрасить лиганды. В консоли я выполню многострочную команду, которую я скопировал-вставил из шпаргалки, о которой я подробно рассказываю в дополнительном видео Jmol.
Результатом этого протокола должна быть модель, которая выглядит так с активным сайтом белка, показанным в виде палочек. А лиганды показали нам палочки в более мягкой цветовой гамме. Желтыми линиями обозначены взаимодействия связывания, а отдельные остатки помечены по желанию.
Интерфейс PyMOL содержит раскрывающиеся меню, средство просмотра структуры, панель имен объектов и меню элементов управления мышью. Основная командная строка также обозначена на этом рисунке. Мы начинаем первичный протокол на шаге 4.4, выбирая остатки в пределах пяти ангстрем для определения активного сайта.
Чтобы выбрать лиганды, нажмите на каждый из них. Появится новый выбор, который можно переименовать, нажав кнопку A. С помощью клавиатуры удалите буквы sele и наберите вместо них ligans.
Нажмите клавишу ВВОД. Мы можем использовать этот выбор для определения области вокруг него. Начните с нажатия кнопки A и выберите дубликат пункта меню.
В этом новом выборе sel01 щелкните A и выберите пункт меню переименования. С помощью клавиатуры удалите существующие буквы и введите active. Это все еще выбор наших трех лигандов, поэтому нам придется изменить его снова, используя кнопку действий A.
Нажмите кнопку, выберите «Изменить» и разверните выделение на пять ангстрем. Теперь мы захватили лиганды и остатки в пределах пяти ангстрем. Кнопка S на S означает шоу.
Нажмите на это, чтобы отобразить белок по-разному. Мы покажем эту солодку в виде палочек. Щелкните в пустом месте, чтобы очистить выделенную область.
Это захватило аминокислоты в пределах пяти ангстрем, но не воду. Мы можем снова, продублировать выделение и теперь изменить его, чтобы выбрать только воду. В действиях кнопки A продублируйте.
Появится выбор 2. Давайте переименуем это в активную воду. На этот раз мы будем использовать кнопку A для изменения, чтобы выбрать атомы вокруг нашего выбора.
Атомы в пределах четырех ангстрем. Это выбрало воду, а также некоторые атомы боковых цепей. Чтобы изменить это дальше, используйте кнопку A для изменения и ограничения сольвентом.
Теперь мы можем видеть, что только молекулы воды загораются. Опять же, в кнопке A мы можем применить пресет. Выберите предустановку, шарик и палку, и теперь молекулы воды отображаются в виде сфер.
Конечным результатом протокола является модель, которая выглядит так с активным сайтом в лигандах, показанным в виде палочек, окрашенных контрастным образом. Желтые линии тире показывают полярно-связывающие взаимодействия, а отдельные остатки помечаются с помощью выделенных областей, созданных на панели объектов «Имена». Ошибки в исполнении протокола могут привести к неоптимальным результатам.
Например, весь белок отображается в виде палочек. Для устранения неполадок пользователю сначала нужно будет скрыть представление палочки для всей структуры. А затем повторно отобразить представление джойстика только для объекта, называемого активным, с помощью кнопки S.
Здесь модели, сгенерированные с помощью каждой программы, показаны рядом. Хотя существуют различия в отображении фермента, одни и те же ключевые особенности и взаимодействия можно увидеть в каждой из четырех моделей. Пользователь, заинтересованный в освоении одной из программ, содержащих командную строку, хочет научиться применять и изменять введенные команды.
Как я упоминал в протоколе Jmol, полезным инструментом является командная шпаргалка. Обычный текстовый файл, содержащий часто используемые коды для ссылки. Чтобы стать продвинутым пользователем, полезно понять, какие части протокола могут быть адаптированы и изменены.
С практикой эти протоколы могут быть применены для моделирования любого ферментного активного сайта, представляющего интерес.
