Важность нашего метода заключается в его способности ответить на вопрос, каковы вязкоупругие свойства зональных волокон, волокон, которые подвешивают хрусталик внутри глаза? Основным преимуществом нашей методики является то, что она может количественно определять вязкоупругие свойства мелких и тонких зонулярных волокон мышей с целевыми генными модификациями и без них. Мутации в генах, кодирующих белки микрофибрилл, лежат в основе нескольких унаследованных синдромных состояний.
Используя нашу технику, мы можем исследовать, как специфические мутации изменяют биомеханические свойства микрофибрилл. Для начала после эвтаназии мыши удалите глаза с помощью мелких щипцов. Вставьте кончик фиксирующей иглы через стенку глаза и расположите его в центре стекловидного тела, заботясь о том, чтобы не повредить хрусталик.
Осторожно переложите пронзенный глаз в трубку, заполненную 4% параформальдегидом и фосфатно-буферным физиологическим раствором. Откройте клапан, соединяющий иглу с фиксированным резервуаром, расположенным на 25 сантиметров выше образца, который поддерживает положительное давление, эквивалентное 15-20 миллиметрам ртутного столба в глазу в течение периода фиксации, и оставьте образец для фиксации на ночь. На следующий день снимите фиксирующую иглу и промойте глаз в течение 10 минут в фосфатно-буферном физиологическом растворе.
Используя офтальмологические хирургические ножницы и стереомикроскоп, сделайте разрез полной толщины в стенке глаза возле головки зрительного нерва. Вытяните разрез вперед к экватору, а затем вокруг экваториальной окружности глаза, тщательно щадя тонкие цилиарные отростки и связанные с ними зональные волокна. Обнажите заднюю поверхность хрусталика, удалив заднюю часть земного шара.
Удалите рассеченный глаз из буферного раствора с помощью щипцов и поместите его на сухую салфетку с роговицей, обращенной вниз. Осторожно перетащите роговицу по поверхности салфетки, чтобы высушить ее. Нанесите каплю мгновенного клея на дно 50-миллиметровой чашки Петри и закрепите к ней платформу.
Поместите блюдо на сценическую пластину стереомикроскопа так, чтобы колодец с клеем был в поле зрения. Чтобы поместить глаз в платформенные колодцы чашки Петри, добавьте три микролитра быстрорастворимого клея. Осторожно поместите его в колодец и быстро отрегулируйте так, чтобы задняя часть линзы была обращена вверх.
Высушите открытую сторону хрусталика, аккуратно промокнув уголком сухой салфетки. Для измерения зонального вязкоупругого отклика включите весы, поместите чашку Петри на весы, затем запустите программу регистрации масштаба и программное обеспечение камеры. Включите контроллер серводвигателя.
Запустите приложение контроллера на компьютере и установите параметры движения с шагом 50 микрометров. Создайте изгиб на 90 градусов в капиллярном стержне. Вставьте изогнутый капилляр в держатель капиллярного зонда и затяните крепежные винты.
К кончику капилляра добавьте небольшую бусину УФ-отверждающего клея. Переместите наконечник капиллярного зонда с помощью ручной регулировки манипулятора и поместите его непосредственно над верхней частью объектива. С помощью переднего визуального осмотра и бокового обзора с помощью камеры микроскопа проверьте, что нижняя часть ультрафиолетового клея кажется центрированной над верхней частью объектива.
Глядя через камеру, опустите наконечник зонда до тех пор, пока ультрафиолетовый клей не вступит в контакт с объективом и не покроет от 1/3 до 1/2 его верхней поверхности. Отвержьте клей, используя направленный почти видимый источник ультрафиолетового света длиной от 380 до 400 нанометров и интенсивностью около одного милливатта. Добавьте раствор PBS в чашку Петри до тех пор, пока глаз не будет покрыт на глубину не менее двух миллиметров.
Поместите цилиндрическую линзу перед микроскопом и вплотную к чашке Петри, не прикасаясь к ней. При этом запустите ведение журнала в программе таймера. Сфотографируйте глаз и зонд с помощью камеры.
Через 60 секунд начните смещение на 50 микрометров. Повторяйте каждые 60 секунд до тех пор, пока эксперимент не будет завершен, как показывает разрыв всех зональных волокон. Сохраните данные журналирования масштабирования после завершения выполнения и экспортируйте их в совместимый формат электронной таблицы.
Кроме того, сохраните снимки объектива, полученные во время бега. Импортируйте данные в электронную таблицу. Используя первое и последнее показания шкалы, интерполируйте дрейф фонового чтения с течением времени из-за испарения, а затем вычтите интерполированный фон из показаний в каждой точке времени.
После выполнения анализа и корректировки на испарение график вязкоупругих данных инвертируется. Величина мгновенных и расслабленных сил увеличивается с каждым шагом примерно до 1000 секунд, а затем падает, когда зонулярные волокна начинают разрываться, пока не будет достигнута 1 500 секундная точка времени, когда все волокна сломаны. Для этой демонстрации также сравнивали вязкоупругую реакцию для мышей дикого типа и с дефицитом MAGP-1.
В начальное время от нуля до 600 секунд графики похожи друг на друга, предполагая, что вязкоупругие свойства зональных волокон существенно не изменились. Однако у нокаутирующей мыши MAGP-1 волокна разрываются преждевременно. Зонулярные силы разрушения волокон были получены методом подтягивания для MAGP-1 по сравнению с мышами дикого типа на стадиях одного месяца и года.
Результаты показали, что прочность волокон увеличивается с возрастом у мышей дикого типа. Любой случайный контакт с чашкой Петри во время этих шагов может привести к смещению глазной стенки относительно глазной линзы, потенциально повреждая зонулярные волокна. Этот анализ подтягивания помогает идентифицировать белки, которые способствуют прочности на растяжение микрофибрилл.
Мы будем использовать эту информацию для построения более реалистичных моделей интерьера из зональных волокон.
