Мы демонстрируем бесчисленные методы для оптического контроля и наблюдения за вызванной клеточной активностью в кардиомиоцитах, полученных из iPSC, для высокопроизводительного скрининга лекарств и теста на токсичность. Обеспечивают многопараметрическую количественную оценку фенотипических паттернов во времени и пространстве, позволяют наблюдать за действием лекарств в течение нескольких часов или дней. Этот метод может быть применен к различным типам клеток, таким как неврозы или бета-клетки, для функционального скрининга и теста на токсичность.
Продемонстрировать процедуру будет Ван-Чи Су, инженер по биовизуализации из моей лаборатории. Подготовьте многолуночную пластину перед тем, как кардиомиоциты iPSC будут удалены из холодного хранилища для размораживания. Покройте каждую лунку 96-луночной микроплиты 100 микролитрами 0,02% раствора желатина с 50 микрограммами на миллилитр фибронектина, чтобы тщательно покрыть все поверхности.
Перенесите кардиомиоциты iPSC из резервуара для хранения жидкого азота на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия. Отнесите флакон в шкаф биобезопасности второго класса и аккуратно перенесите содержимое в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую девять миллилитров среды комнатной температуры. Центрифугируйте ячейки в 200 раз G в течение трех минут при комнатной температуре.
Отбросьте супернатант пипеткой и осторожно повторно приостановите клетки в одном миллилитре среды с 10 микромолярным ингибитором ROCK Y27632. Пластинчатые ячейки покрывали 96 пластин скважин плотностью от 100 000 до 150 000 ячеек на квадратный сантиметр в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа убедитесь, что клетки, прикрепленные к поверхности пластины, находятся в контакте с другими клетками.
После покрытия клеток в течение 72 часов разморозьте вирусные наборы GECI на льду. Приготовьте вирусный набор двойной силы с помощью поддерживающей среды. Подготовьте клетки к инфекции, регулируя объем среды до 100 микролитров на лунку.
Добавьте 100 микролитров предварительно смешанного вирусного раствора в лунки и инкубируйте в течение восьми-16 часов при 37 градусах Цельсия. После инкубации замените 200 микролитрами предварительно нагретую среду. Визуализируйте выражение GECI через 24 часа после трансдукции с помощью системы визуализации.
Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе перед проведением функциональных анализов. Включите все устройства системы обработки изображений с высоким содержанием. Убедитесь, что температура камеры достигает 37 градусов по Цельсию с добавлением углекислого газа 5%.
Откройте программное обеспечение для визуализации и выберите настройку пластины для пластины на 96 скважин. Поместите в камеру пластину 96 скважин без крышки и загрузите сверху уплотнительное кольцо живой ячейки. Выберите объектив с погружением в воду 20X, 60X и 20X в соответствии с требуемым пространственным разрешением.
Настройте фокус, чтобы сделать четкие изображения перед экспериментальным получением. Выберите от трех до пяти областей случайным образом на скважину для регистрации активности кальция. Выберите подходящие фильтры для разных индикаторов.
Установите соответствующую мощность светодиода для каждого используемого канала изображения. Установите время экспозиции камеры максимум на 40 миллисекунд или 25 герц, а продолжительность записи 30 секунд для захвата потока для наблюдения переходных процессов кальция, о которых сообщают зонды MNG-GECO и K-GECO, экспрессируемые в кардиомиоцитах. Увеличьте мощность светодиода, если отношение сигнал/шум меньше двух при более высокой частоте кадров.
Для оптогенетической стимуляции оптимизируйте мощность и частоту синего света на уровне одного герца и начните сбор. Повторно суспендировать дофетилид E4031 и верапамил в ДМСО и разбавить их буфером Тирода. Хорошо расположите соединения к соответствующей мишени.
Добавьте 100 микролитров соединения двойной прочности через автоматическую микрожидкую систему в скважины и начните сбор после желаемого инкубационного периода. Изолируйте область сигнала от фона, автоматически обнаруживая функцию импульсов с временным разрешением с помощью программного обеспечения. Используйте программное обеспечение для анализа пиков кальция для анализа частоты биения, пикового сигнала, длительности переходных процессов кальция 50% переходной продолжительности кальция 90% времени нарастания и времени распада.
На видео демонстрируется наблюдение спонтанного колебания кальция в NMG-GECO, экспрессируемого кардиомиоцитами, полученными из iPSC, с медикаментозным лечением или без него. Кинетические следы, полученные с помощью MNG-GECO, показали, что ингибиторы малых молекулярных ионных каналов Верапамил, Дофетилид и Е4031 влияли на переходные процессы кальция, как и ожидалось. Для оценки дозовой реакции E4031 в стандартизированных, темповых условиях каналодерходепсин-2 и K-GECO экспрессирующие iPSC CM оптически контролировали с использованием одного герца и 470 нанометровых импульсов света и наблюдали с использованием красного сигнала K-GECO.
Прогрессирующее уменьшение пиковой амплитуды и увеличение времени распада переходных процессов кальция происходят при увеличении концентрации Е4031. Дозозависимый эффект Е4031 был наиболее очевиден для снижения пиковой амплитуды. Прозрачные переходные процессы кальция остаются видимыми через месяц после вирусной трансдукции или без дополнительного света, используемого для оптического кардиостимуляции.
На графике изображен препарат, который, по-видимому, увеличивает скорость биения, упорядочивает интервал сокращения и увеличивает переходную амплитуду кальция в режиме LVNC iPSC CM. Изменчивость частоты биения и последующее влияние на временную продолжительность кальция также изменяются по мере поддержания iPSC CM в культуре. Несколько GECI, в том числе ER LAR-GECO, MTG-Sepia и NIR-GECO, были разработаны для экспрессии по отдельности или в комбинации в клеточных моделях для измерения активности кальция в реальном времени, возникающей в эндоплазматическом ретикулуме, саркоплазматическом ретикулуме, митохондриях и цитозоле, соответственно.
GECI могут быть объединены в модель iPSC CM для изучения различных внутриклеточных запасов кальция. K-GECO, экспрессирующие кардиомиоциты, показали последовательное поведение биения с течением времени. Однако нагрузка Fluo-4 повлияла как на частоту ударов, так и на CTD в этой модели, предполагая, что Fluo-4 сам по себе может влиять на результаты таких экспериментов.
Мы предоставляем простой способ изучения фенотипических профилей из контрольных и производных от пациента клеток, в то время как промежуточный iPSC может пролить свет на открытие лекарств при различных заболеваниях.
