Этот протокол является нашим методом на основе клеток для прекращения холестерина холестерина рефлюкс в керамальной плазме. Особенно в показах. Это может быть применено для диагностики сердечно-сосудистого риска, а также для выявления или оценки снижения уровня холестерина.
Этот метод позволяет избежать риска и бремени, как безопасность с обработкой излученных материалов, предоставляя результаты с сопоставимыми уровнями качества, к тем, холестерин рефлюкс, как сообщается, ассоциируется с Таким образом, плазмы или керамального холестерина рефлюкс принято можно сравнить, к нашей ссылки контроля и может обеспечить риск страдать от этого метода также будет применяться к клеточным линиям , как и другие линии клеток человека или даже первичные макро фазы. Макро фазы или индуцированных человеком стволовых клеток кнопки спрей. Чтобы начать эту процедуру, растворить холестерин NPD в чистом этаноле, чтобы получить фондовый раствор с окончательной концентрацией двух микромоляров.
Разбавить 25 микролитров холестеринового запаса NBD в среде AR 10, чтобы достичь конечной концентрации пяти микромоляров. Культура thp-1 клеток в нашей среде 10 при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. Каждые три дня настраивайте плотность клеток до 300 000 клеток на миллилитр.
Затем получить 96-хорошо пластины с плоским ясным дном. Для лучшей гомогенизации приготовьте 10 миллилитров клеток thp-1 в 15 миллилитровой трубке и добавьте 200 микролитров запаса PMA. Смешайте осторожно и семян 100 микролитров смеси в пластины скважин на 200000 клеток на скважину.
И инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение 48 до 72 часов, чтобы дифференцировать клетки thp-1 в DM thp-1 клеток. Первый разбавить глицин в 10%PBS со стерильной водой, в концентрации 200 микромолей при рН 7,4. Добавить 40 миллилитров разбавленного глицина до 10 граммов колышек 8000, чтобы подготовить 20%peg раствор, и энергично перемешать, чтобы гомогенизировать.
Затем нанесите четыре части по 20% на 10 частей образца на каждый образец сыворотки или плазмы в трубке 1,5 мл. Оставьте смесь на льду на 25 минут. Центрифуга колышек аполипопротеин B осаждается в 13000 раз G, и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут.
Отбросьте осадок и перенесите супернатант в новую трубку. Извлеките пластину, содержащую дифференцированные клетки thp-1. Удалите и отбросьте культурную среду, а затем дважды промыть клетки с помощью 1X PBS.
Добавьте 100 микролитров 5 микромоляных холестерина MVD в АР-10 среды к каждой хорошо. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. На следующий день отбросьте, отбросьте носитель.
Вымойте клетки дважды с PBS, а затем добавить 100 микролитров ABDS, или очищенный липидный приемщик разбавленный в rpmi 1630 среды к желаемой концентрации к каждой хорошо. Включите отрицательный контроль, который не содержит холестерина принимает в положительном контроле, как указано в текстовом протоколе, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение четырех-шести часов. Между тем, подготовить 200 миллилитров запасов клеточного лиза решение 1, как указано в тексте.
Смешайте это решение с этанолом, при соотношении один к одному объему, чтобы получить раствор лиза тоже. Для обнаружения холестерина в средствах массовой информации и BD удалите клеточную среду из пластин, собранных в новую белую пластину 96-колодец с непрозрачным плоским дном. Добавьте 100 микролитров чистого этанола в 100 микролитров каждого среднего образца, чтобы получить соотношение один к одному в новой пластине.
Используя иллюминометр, измеряйте интенсивность флуоресцентных ламп при возбуждении 463 нанометров и выбросе 536 нанометров. Для внутриклеточного обнаружения холестерина NBD, мыть клетки дважды с PBS. Добавить 100 микролитров раствора лиза тоже к каждой хорошо, и инкубировать при комнатной температуре, в то время как тряска в течение 25 минут.
После этого измерьте интенсивность флуоресцентных ламп при регулировке параметра чувствительности до 50 в программном обеспечении. Затем определить уровень холестерина эффлюкса в окончательной мере холестерина efflux, как указано в текстовом протоколе. Разбавление холестерина NBD в чистом этаноле производит самые высокие значения интенсивности флуоресцентных в то время как высокое содержание в aqueous растворе, снижает интенсивность.
Это говорит о том, что излучение этой молекулы флуоресцентными лампами сильно зависит от среды, в которой она содержится. При использовании смеси средств массовой информации и этанола в соотношении один к одному, интенсивность флуоресцентных, кажется, увеличивается пропорционально, с концентрацией холестерина аналог, предполагая, что зонд ведет себя надлежащим в этих условиях. Чтобы определить количество времени, необходимое для инкубации загруженных клеток с холестерином приемов, клеточные средства массовой информации собирают в разных точках времени.
Эффлюкс холестерина эволюционировал линейно от нуля до шести часов, при этом максимальный сигнал был захвачен через шесть часов после добавления ABDS в клетки. Порог насыщения и динамический диапазон проверяются путем измерения эффлюкса холестерина на разных процентах HDL, содержащих средства массовой информации. В высокой пропускной способности актива, эффлюкс развивается линейно от одного до 7%ABDS, достигнув пика холестерина efflux потенциала на 7%При концентрациях выше, чем 7%интенсивность флуоресцентных уменьшается в обратной связи с процентом ABDS.
Производительность метода на основе флуоресценции затем оценивается путем сравнения его со стандартной радио помеченной техникой. Оба метода сильно коррелируют при использовании различных концентраций ABDS. Описанный метод чувствителен к увеличению концентрации приемора в значениях холестерина эффлюкса между 5 и 15%Важно обеспечить, чтобы целлааризер не содержит агрегатов.
Критическим моментом является оценка совокупного этанола, содержащего окружающую среду, для измерения флуоресценции в однородном и оптимальном весе. После этой процедуры, название технического холестерина может быть измерена, и влияние препаратов в холестерин эффлюкс путь может быть определена. Кроме того, школа в конечном итоге будет использоваться в качестве диагностики ослов сердечно-сосудистого риска.
Мы считаем, что этот метод гораздо проще и безопаснее, чем метод радиоактивного стандарта. Однако он по-прежнему зависит от клеток. Пожалуйста, помните, что этанол является воспламеняемым и он должен храниться и обрабатываться соответствующим образом.
