В раннем эмбрионе дрозофилы многие органеллы подвергаются крупномасштабному движению. Наш протокол описывает, как контролировать это движение с помощью флуоресцентных красителей, разработанных для клеточной культуры. По сравнению с флуоресцентными белками, коммерчески доступные флуоресцентные зонды ярче и охватывают более широкий диапазон спектра.
Они допускают мультиплексное колабелирование и могут быть использованы в любом генетическом фоне. Требуется практика и метод проб и ошибок, чтобы знать, как долго высушиваются эмбрионы, чтобы они либо лопнули во время инъекции, либо высохли и перестали развиваться. Для начала начните подготовку инъекционных игл, поместив капилляр в капиллярный держатель на съемнике иглы и закрепив его с помощью крыльевых гаек.
Выровняйте центр капилляра с нагревательным элементом. Согласно инструкции производителя, выбирайте соответствующие настройки на съемнике иглы. Используя рассекающий микроскоп, выполните тест контроля качества.
Вдавите иглы в шпаклевку горизонтально с подвешенными в воздухе кончиками игл. Накройте иглы крышкой и храните до использования. Используя наконечники для загрузки иглы, прикрепленные к микропипетке, втяните один микролитр инъекционного раствора в наконечник без улавливания пузырьков воздуха.
С помощью перчаток держите иглу в одной руке, направляя ее кончик в сторону, и вставьте в нее загрузочный наконечник. Дозируйте жидкость возле кончика иглы, снимите пипетку и держите иглу вертикально, пока жидкость не потечет к кончику. Накройте контейнер алюминиевой фольгой, не повреждая кончики игл, чтобы предотвратить отбеливание красителей.
Используя передаточную пипетку или микропипеттер, поместите небольшую каплю гептанового клея в центр прямоугольного покровного скольжения и дайте ему испариться. Для механического удаления хориона накройте соответствующим образом выдержанную пластину эмбриона тонким слоем галоуглеродного масла 27, чтобы сделать яичную скорлупу прозрачной. Просмотрите пластину под рассеченным микроскопом с транс-подсветкой, чтобы подтвердить стадию эмбриона и выбрать эмбрионы в стадиях расщепления.
С помощью тонкого пинцета подберите зародыш нужной стадии, захватив спинные придатки и перенесите его на подготовленную стеклянную горку, покрытую двусторонней лентой. Поместите эмбрион на ленту и сведите к минимуму перенос масла. Аккуратно прокатите эмбрион по поверхности ленты, подталкивая стороной кончика пинцета, не тыкая его напрямую.
Продолжайте катать эмбрион до тех пор, пока хорион не прилипнет к ленте и не треснет. После того, как хорион треснет, продолжайте катать эмбрион, чтобы отделить его от хориона, который остается прилипшим к ленте. Сверните эмбрион обратно на хорион, который менее клейкий, чем лента.
Аккуратно натрите эмбрион пинцетом, пока он не прикрепится к пинцету для переноса. Затем перенесите эмбрион на покровный слип и приведите его в контакт с клеем, чтобы удержать эмбрион на месте, отделив его от пинцета. Отрегулируйте ориентацию эмбриона на крышке.
Дайте эмбрионам высохнуть в течение пяти-12 минут, поместив крышку с эмбрионами в камеру высыхания и запечатав ее. Снимите крышку с камеры и положите каплю галогенуглеродного масла 700, покрыв эмбрионы для предотвращения дальнейшего высыхания. Осмотрите их под рассечением и приступайте к микроинъекции, если эмбрионы были высушены должным образом.
Поместите объектив 4X на траекторию света и, используя ручку фокусировки на микроскопе, отрегулируйте эмбрионы в фокус. Переместите эмбрионы горизонтально в центр поля зрения с помощью элементов управления рабочей области. Держите эмбрионы на краю поля зрения и откладывайте их подальше, готовясь к опусканию иглы.
Оставаясь в одной фокальной плоскости, опустите кончик иглы и убедитесь, что он виден в поле зрения вместе с эмбрионами. Проверьте, что игла функционирует, дозировав часть инъекционного раствора в галогенуглеродное масло 700. В случае успеха в масле возле кончика иглы появится пузырь раствора.
Используя элементы управления стадией, перемещайте эмбрион к кончику иглы до тех пор, пока наконечник мягко не проколет эмбрион и не войдет в него. Одновременно начинают подачу инъекционного раствора до тех пор, пока на месте кончика иглы не появится переходное прозрачное пятно, свидетельствующее об успешном переносе раствора в эмбрион. Закрепите крышку на конфокальном микроскопе с помощью держателя слайда.
Соблюдайте осторожность, так как скольжение крышки хрупкое. Осмотрите эмбрионы, используя функцию эпифлуоресценции на конфокальном микроскопе с целью 40X и убедитесь, что флюор 4 в эмбрионе виден, прежде чем продолжить. Для изображений в реальном времени во время синцитиальных этапов задайте размер изображения 512 на 512 пикселей, среднее линейное значение три и частоту кадров 0,1 кадра в секунду.
После введения красителя BODIPY 493 503 он локализовался в месте, где был вставлен наконечник иглы, а затем диффузировался рядом с местом инъекции. Через 24 минуты краситель диффундирует за пределы средней точки эмбриона. Моторику органелл контролировали путем введения эмбриону BODIPY 493 503 и LysoTracker Red.
Анализ велоциметрического изображения частиц показал, что эмбриональное содержимое сходится в центральной области эмбриона, где цитоплазма течет внутрь эмбриона. Маркировка ER с использованием ER-Tracker Green обеспечивает яркое разрешение ядерной оболочки, позволяя визуализировать основные стадии клеточного цикла. Эмбриону вводили MitoView 633 на стадии бластодермы и визуализировали четыре часа спустя.
На снимке показана нейроэктодермальная клетка эмбриона в расширении зародышевой полосы. Клеточному эмбриону вводили смесь BODIPY 493 503 и SiR Tubulin, которая показывает, что липидные капли движутся двунаправленно вдоль микротрубочек. Эмбрион должен быть частично высушен, чтобы можно было вводить жидкость.
Слишком малое высыхание приведет к утечке эмбриона при инъекции, слишком сильное высыхание убьет эмбрион. Видео движущихся органелл можно охарактеризовать с помощью различных методов анализа изображений. Отслеживание частиц выявляет поведение отдельных органелл, визуализация частиц велоциметрия выявляет объемный поток.
