Эти протоколы помогут любому исследователю включить использование линий клеток Drosophila для привода или дополнения их исследовательской повестки дня. Большинство, если не все культуры клеток Drosophila оживить, размножаться, и крио-сохранить хорошо при работе в соответствии с этими руководящими принципами. После вытирания рабочей поверхности ламинарного потока капот с 70% этанола, обойтись пять миллилитров соответствующей среде в 25 сантиметров в квадрате Т-колбу.
Протрите контейнер замороженной клеточной линии 70%этанолом и осторожно ослабьте и опечатайте крышку. Используя пипетку Pasteur, перенесите один миллилитр среды комнатной температуры из колбы в крио-флакон и аккуратно перемешайте, чтобы разморозить замороженные клетки. Заботясь о том, чтобы подвеска клетки не переполнялась, перенесите весь объем талой клеточной подвески в колбу и прополощите крио-флакон свежей средой.
Позвольте клеткам осесть на дне колбы, по крайней мере два часа в 25 градусов по Цельсию инкубатора. Не возвращайм замороженные клетки, которые были упакованы для путешествия обратно в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию в течение длительного периода времени или в жидкий азот. Вместо этого оттаивать клетки как можно скорее.
Подтвердив вложение под световым микроскопом, аккуратно замените супернатант пятью миллилитров свежей среды, прежде чем вернуть колбу в инкубатор. Кроме того, после оттаивания, передача подвески клетки в 15 миллилитров конической трубки для центрифугации и повторно приостановить гранулы в пять миллилитров свежей среды перед посевом в колбу Т-25, как только что продемонстрировали. Чтобы определить, готовы ли клетки к прохождению, изучите морфологию и слияние культуры под микроскопом.
Учитывая плотность клеток и удвоение времени, в последний раз клетки были суб-культурных, и любые признаки загрязнения микроорганизмов в культуре. Если культура представляется весьма сотрясающимся, используйте десять миллилитров супернатанта культуры, чтобы аккуратно выбить клетки из дна пластины культуры и определить плотность клеток, подсчитав количество жизнеспособных клеток в полученной одноклеточной подвеске. Суб-культура клеток, если плотность клеток составляет от пяти до десяти раз десять до шестой клетки на миллилитр в соответствующей среде.
Добавьте по крайней мере один раз десять к шестой клетки на миллилитр концентрации в новой пластине культуры для достижения желаемой плотности посева клеток. Затем накройте и обозначить пластины с оператором инициалы, дата, соотношение сплит, плотность посевных клеток, идентификатор линии клеток, средний, проход номер, и любые средние дополнения, такие как антибиотики, и поместите пластины в пластиковый контейнер для их дальнейшей инкубации в 25 градусов по Цельсию инкубатор. Чтобы выбить клетки-адепты из 100-миллиметрового культурного дна, сначала перенесите все супернатанты в стерильную колбу и промойте клетки с медленным добавлением одного миллилитра 0,05%трипсина ЭДТА.
Аккуратно вихрем, чтобы убедиться, что трипсин решение охватывает всю поверхность роста, прежде чем отказаться от решения. Затем аккуратно добавьте от одного до двух миллилитров свежего 0,05%трипсина EDTA к пластине и поместите пластину в инкубатор 25 градусов по Цельсию в течение трех-десяти минут. Когда клеточный слой можно наблюдать отсоединения и скольжения от растущей поверхности, остановить трипсин деятельности с добавлением девяти миллилитров сохраненных supernatant и смешать подвеску клетки тщательно разъединить клетки сгустки.
Когда все клетки будут выбиты, растущая поверхность будет ясной. Чтобы вручную подсчитать клетки с помощью слайда подсчета клеток Neubauer, сначала протрите поверхность слайда гемоцитометра и накройте скольжение 70% алкоголя. После смешивания добавьте 15 микролитров клеток в каждый рифленый край гемоцитометра, чтобы заполнить обе камеры.
Подвеска ячейки будет втянута в счетную камеру капиллярным действием. Используя цель 10x микроскопа, подсчитайте от 100 до 200 ячеек в пределах одной миллиметровой площади в квадрате в середине сетки, связанной параллельными линиями. Затем повторите перечисление со второй камерой и используйте среднее значение двух подсчетов для определения плотности клеток в соответствии с формулой.
Для крио-сохранения крио-сохранения линии drosophila повторно приостанавливайте клеточные гранулы в объеме замораживания среды, что приведет к окончательной плотности клеток по крайней мере в четыре раза от десяти до седьмого клетки на миллилитр. Добавьте соответствующий объем крио-защиты, диметилсульфсид или DMSO, в падение подвески клетки таким образом, чтобы окончательная концентрация DMSO составила 10% и аккуратно смешивала подвес клетки. Затем аккуратно добавьте 0,5 миллилитров алициты клеточной суспензии в предварительно помеченные крио-флаконы и поместите крио-флаконы в замораживающий контейнер, наполненный изопропанолом.
Затем перенесите замораживающий контейнер в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию в течение ночи, чтобы температура крио-флаконов медленно опускаться до температуры морозильной камеры. Далее, быстро перенося крио-флаконы на рысы для вставки в канистру с жидким азотом. Кроме того, перенесите замороженные крио-флаконы в предварительно охлажденое замораживание коробки и храните замороженные крио-флаконы в жидкой фазе азотной морозильной камеры.
Слияние клеточной линии можно определить с помощью светового микроскопа. Быстро растущие клеточные линии, которые достигают слияния рано должны быть прохождение регулярно, до двух раз в неделю. В отличие от этого, медленно растущие клетки могут быть пролет по крайней мере один раз в две недели или дольше, хотя эти клетки должны быть накормлены свежей среде каждую неделю.
Клеточные линии, полученные из различных источников тканей, отличаются по морфологии, свойствам присоединения, требованиям к средствам массовой информации и времени удвоения. Для количественных экспериментов, подсчет клеток имеет важное значение. Клетки можно пересчитать с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика частиц.
Слияние клеток является визуальным руководством, когда субкультуры для опытного оператора. Тем не менее, подсчет клеток приводит к предсказуемому графику субкульирования и облегчает выявление аномалий роста. Будьте осторожны и используйте соответствующее защитное снаряжение при работе с жидким азотом.
