Взаимодействие лейкоцитов и эндотелиальных клеток играет важную роль при воспалительных заболеваниях, таких как сепсис. Нарушение регуляции воспаления часто вызывает изменение барьерной функции эндотелия сосудов и чрезмерный трафик лейкоцитов, что может привести к повреждению органов. Биомиметический микрофлюидный анализ, который мы называем bMFA, воспроизводит топографию и условия потока микрососудистых сетей in-vivo и позволяет в режиме реального времени оценивать прокатку, твердую адгезию, распространение и миграцию нейтрофилов в тканевый компартмент.
Сильной стороной биомиметического микрофлюидного анализа является способность использовать первичные клетки человека и клинически значимые образцы пациентов для увеличения клинического перевода и быстрого скрининга потенциальных терапевтических средств. Демонстрировать процедуры будет г-н Цинлян Ян, аспирант-исследователь из моей лаборатории. Начните вставлять трубку длиной около одного дюйма в порты, используя тонкие щипцы, за исключением одного входного порта.
Используя щековые зажимы, зажмите два выходных порта и тканевый отсек вместе. Разбавить раствор фибронектина до 100 мкг на миллилитр с помощью PBS. Загрузите одномиллилитровой шприц, соединенный с тупой иглой 24-го калибра с разбавленным раствором фибронектина, и подключите шприц к трубке длиной четыре дюйма.
Вставьте трубку в открытый входной порт, затем нажмите плунжер до тех пор, пока фибронектин человека не будет освобожден из другого входного отверстия, и зажмите его. Повторяйте процесс для оставшихся портов до тех пор, пока все каналы, тканевый отсек и трубки не будут заполнены раствором фибронектина человека. Извлеките иглу, но держите трубку длиной четыре дюйма вставленной и незажатой.
Для выполнения дегазации подключите незажатую трубку к пневматической грунтовке, подключенной к резервуару для сжатого азота с давлением пять фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут. Под микроскопом проверьте, что в канале или тканевом отсеке нет пузырьков воздуха, и снова подключите устройство, если пузырьки воздуха присутствуют. Снимите прибор с пневматической грунтовки и высиживайте его при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Используя предварительно нагретые микрососудистые эндотелиальные клеточные питательные среды легких человека, промывают все каналы и тканевый компартмент. После сбора эндотелиальных клеток, как описано в текстовой рукописи, гранулируйте клетки центрифугированием в течение пяти минут в 150 раз G.In программируемый шприц-насос, установите шприц в один миллилитр и прикрепите трубку к тупой игле. Втяните примерно 20 микролитров клеточной суспензии в трубку, не впуская ее в шприцевой ствол.
Снимите зажим с выходного порта устройства. Подключите трубку к входному отверстию без введения пузырьков воздуха в канал. Остановите насос со скоростью потока от четырех до восьми микролитров в минуту и наблюдайте под микроскопом.
Остановите насос, когда каналы заполнены ячейками. Зажмите выходное отверстие и отрежьте впускную трубку. Поместите устройство в инкубатор на четыре часа при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия.
После четырех часов инкубации подготовьте еще один шприц и наполните его свежей клеточной культуральной средой. Установите шприц в шприцевой насос и подключите его к входному порту. Снимите зажим с выходного отверстия.
Пропускайте свежие носители через устройство в течение примерно пяти минут со скоростью от четырех до восьми микролитров в минуту, чтобы удалить плавающие или неприкрепленные ячейки. Приготовьте шприц, заполнив его свежими питательными средами для культивирования клеток. Установите шприц в шприцевой насос и подключите его к одному входному порту, сохраняя выходной порт открытым.
Поместите устройство в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Запрограммируйте шприцевой насос для культивирования эндотелиальных клеток под потоком, как описано в текстовой рукописи. Используя микроскоп, проверьте bMFA после 48 часов посева под потоком.
Конфокальная микроскопия показала, что все поверхности сосудистых каналов были покрыты эндотелиальными клетками, образующими полный 3D-просвет в bMFA. После приготовления трех различных устройств bMFA загрузите три одномиллилитрных шприца с клеточной культуральной средой или TNF-альфа или TNF-альфа в сочетании с ингибитором дельты PKC соответственно, где TNF-альфа и воспалительный цитокин используются для стимуляции эндотелиальных клеток и нейтрофилов. Дельта-ингибитор PKC является новым противовоспалительным ингибитором.
Подключите три нагруженных шприца к трем устройствам bMFA. Используя буфер TNF-альфа или TNF-альфа с добавлением ингибитора, обрабатывайте микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека в течение четырех часов со скоростью 0,1 микролитра в минуту. После выделения нейтрофилов человека, как описано в рукописи текста, повторно суспендируют нейтрофилы в 999 микролитрах буфера HEPES и добавляют один микролитр 10-миллимолярного раствора красителя CFDA SE в суспензию, в результате чего получается 10-микромолярный рабочий раствор CFDA SE и инкубируют его в течение 10 минут при комнатной температуре.
Промывайте клетки дважды буфером HEPES путем центрифугирования раствора в течение пяти минут в 315 раз G. После подсчета клеток повторно суспендируют при 2 миллионах нейтрофилов на миллилитр в среде клеточной культуры или TNF-альфа или TNF-альфа, добавленные с ингибитором дельты PKC, и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Наполните шприц одномикроляром химиоаттрактанта, fMLP, приготовленным в среде клеточной культуры. Откройте один входной и один выходной порт bMFA.
Извлеките трубку из тканевого отсека и вставьте трубку fMLP. Вводят приблизительно 20 микролитров fMLP в тканевой компартмент для всех bMFA, оставляя тот, который обработан клеточными культуральными средами. Отрежьте трубку и зажмите ее.
Наполните шприц примерно 200 микролитрами нейтрофильной суспензии и установите шприц на шприцевом насосе. После размещения устройства на перевернутой ступени микроскопа установите скорость потока на уровне одного микролитра в минуту и запустите насос. Подождите, пока небольшая капля нейтрофильной суспензии выйдет из трубки и вставьте трубку во входное отверстие.
Флуоресцентно меченые нейтрофилы проникают в сосудистые каналы и взаимодействуют с эндотелиальными клетками и физиологически значимыми условиями потока. Через 10 минут после начала эксперимента откройте программное обеспечение для анализа изображений, переключите объектив на 10x и используйте джойстик сцены, чтобы центрировать устройство под микроскопом. Чтобы получить карту адгезии, перейдите в раздел Приобретение, щелкните Сканировать большое изображение.
Появится новое окно. Выберите объектив 10x и установите параметр поля, например, 5 на 3. Нажмите кнопку Сканировать, выберите Файл и сохраните карту адгезии.
Чтобы получить карту миграции для анализа миграции, центрируйте устройство под микроскопом с помощью джойстика стадии. Щелкните Вид, Элементы управления приобретением, Приобретение ND. Появится новое окно.
Задайте путь для сохранения файла и введите имя файла. Отметьте функцию «Большое изображение», установите «Область сканирования», например, 5 на 3. Проверьте функцию Время, установите интервал как пять минут, а продолжительность как 60 минут.
Делайте покадровые снимки тканевого отсека, причем одно изображение делается каждые пять минут в течение следующего часа. Моделирование CFD показывает ламинарный рисунок потока в сосудистых каналах, за исключением областей бифуркации, где картина потока нарушена. После выполнения биомиметического микрофлюидного анализа фазово-контрастные изображения показали, что поверхности сосудистых каналов были покрыты эндотелиальными клетками и выровнены в направлении сдвигового потока после 48 часов культивирования.
Флуоресцентную визуализацию проводили с помощью конфокальной микроскопии, указывающей на то, что эндотелиальные клетки образуют полный трехмерный просвет в bMFA Получена карта адгезии нейтрофилов, которая показала, что в bMFA наблюдается значительная адгезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам. Карта миграции нейтрофилов в bMFA показала, что при активации TNF-альфа происходит значительная миграция нейтрофилов внутри тканевого компартмента, в то время как без активации TNF-альфа такая миграция не наблюдалась. Карта адгезии, коррелирующая пространственное распределение нейтрофилов со скоростью сдвига, показала, что адгезия нейтрофилов происходила преимущественно в сосудах с низкой скоростью сдвига и вблизи бифуркационных областей.
Кроме того, лечение TNF-альфа значительно увеличивает адгезию, которая ингибировалась ингибитором дельты PKC. Анализ изображений замедленной съемки показал, что активация TNF эндотелиальных клеток увеличивает миграцию нейтрофилов в ответ на fMLP, тогда как лечение ингибитором дельты PKC снижает миграцию по сравнению с клетками, обработанными TNF-альфа. Таким образом, bMFA может быть использован для проверки эффективности нового терапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний.
bMFA также может быть использован для изучения целостности эндотелия путем измерения таких переменных, как проницаемость и трансэндотелиальное электрическое сопротивление, то, что называется TEER, и экспрессия молекулы адгезии во время воспаления. Биомиметический микрофлюидный анализ может имитировать микроокружение различных органов и не ограничивается отдельными типами клеток или видами, а также может моделировать клеточную / клеточную связь, критическую для функции органов и моделирования различных заболеваний.
