As interações leucócito-endotelial desempenham um papel importante em doenças inflamatórias, como a sepse. A desregulação da inflamação muitas vezes causa uma função alterada da barreira do endotélio vascular e o tráfico excessivo de leucócitos, o que pode resultar em danos aos órgãos. O ensaio microfluido biomimético, o que chamamos de bMFA, reproduz condições de topografia e fluxo de redes microvasculares in-vivo e permite a avaliação em tempo real de rolagem, adesão firme, disseminação e migração de neutrófilos para o compartimento tecidual.
Uma força do ensaio microfluido biomimético é a capacidade de usar células humanas primárias e amostras de pacientes clinicamente relevantes para aumentar a tradução clínica e rapidamente testar potenciais terapêuticos. Demonstrando os procedimentos estará o Sr. Qingliang Yang, um assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Comece a inserir o tubo de cerca de uma polegada de comprimento dentro das portas usando fórceps finos, exceto por uma porta de entrada.
Usando grampos na mandíbula, fixar as duas portas de saída e o compartimento de tecido juntos. Diluir a solução de estoque de fibronectina para 100 microgramas por mililitro com PBS. Carregue uma seringa de um mililitro conectada a uma agulha cega de 24 calibres com a solução de fibronectina diluída e conecte a seringa a uma tubulação de quatro polegadas de comprimento.
Insira a tubulação na porta de entrada aberta e empurre o êmbolo até que a fibronectina humana seja liberada de outra porta de entrada e aperte-a. Repita o processo para as portas restantes até que todos os canais, compartimento de tecido e tubos estejam preenchidos com a solução de fibronectina humana. Remova a agulha, mas mantenha o tubo de quatro polegadas de comprimento inserido e sem farol.
Para realizar a desgaseamento, conecte a tubulação nãoclampada ao primer pneumático conectado a um tanque de nitrogênio comprimido com uma pressão de cinco libras por polegada quadrada por 15 minutos. Sob o microscópio, verifique se não há bolhas de ar presas dentro do canal ou compartimento de tecido e reconecte o dispositivo se as bolhas de ar estiverem presentes. Remova o dispositivo do primer pneumático e incuba-o a 37 graus Celsius durante uma hora.
Usando mídia de cultura de células microvasculares microvasculares do pulmão humano pré-aquecida, lave todos os canais e compartimento de tecido. Depois de colher as células endoteliais como descrito no manuscrito do texto, pelotar as células por centrifugação por cinco minutos a 150 vezes G.In a bomba de seringa programável, montar uma seringa de um mililitro e anexar a tubulação à agulha cega. Desenhe aproximadamente 20 microliters da suspensão da célula para dentro da tubulação sem deixá-lo entrar no barril de seringa.
Remova o grampo da porta de saída do dispositivo. Conecte a tubulação à porta de entrada sem introduzir nenhuma bolha de ar no canal. Pare a bomba com uma taxa de fluxo de quatro a oito microlitros por minuto e observe sob o microscópio.
Pare a bomba quando os canais estiverem cheios de células. Aperte a saída e corte a tubulação de entrada. Coloque o dispositivo na incubadora por quatro horas a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius.
Depois de quatro horas de incubação, prepare outra seringa e preencha-a com novas mídias de cultura celular. Monte a seringa em uma bomba de seringa e conecte-a à porta de entrada. Remova o grampo da porta de saída.
Passe a mídia fresca através do dispositivo por cerca de cinco minutos a quatro a oito microliters por minuto para remover as células flutuantes ou não.. Prepare uma seringa preenchendo-a com mídia de cultura celular fresca. Monte a seringa em uma bomba de seringa e conecte-a a uma porta de entrada, mantendo a porta de saída aberta.
Coloque o dispositivo em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Programe a bomba de seringa para cultivar células endoteliais sob fluxo, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando um microscópio, verifique bMFA após 48 horas de cultura sob fluxo.
A microscopia confocal indicou que todas as superfícies dos canais vasculares estavam cobertas por células endoteliais, formando um lúmen 3D completo em bMFA. Depois de preparar três dispositivos diferentes de bMFA, carregue três seringas de um mililitro com mídia de cultura celular ou TNF-alfa ou TNF-alfa combinados com inibidor delta PKC, respectivamente, onde tnf-alfa e citocina inflamatória é usado para estimular células endoteliais e neutrófilos. O inibidor delta PKC é um novo inibidor anti-inflamatório.
Conecte as três seringas carregadas a três dispositivos bMFA. Usando tampão TNF-alfa ou TNF-alfa com inibidor adicionado, trate células endoteliais microvasculares pulmonares humanas por quatro horas a 0,1 microliters por minuto. Depois de isolar os neutrófilos humanos como descrito no manuscrito do texto, resuspensar os neutrófilos em 999 microliters de tampão HEPES e adicionar um microliter de 10 milimônios solução de corante CFDA SE à suspensão, resultando em uma solução de trabalho de 10 micromolars da CFDA SE e incuba-lo por 10 minutos à temperatura ambiente.
Lave as células duas vezes com tampão HEPES, centrifugando a solução por cinco minutos a 315 vezes G.Depois de contar as células, resuspenque em 2 milhões de neutrófilos por mililitro em mídia de cultura celular ou TNF-alfa ou TNF-alfa adicionado com inibidor de delta PKC e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Encha a seringa com um micromolar de um atrativo de quimioterapia, fMLP, preparado em meios de cultura celular. Abra uma entrada e uma porta de saída da bMFA.
Remova a tubulação da porta do compartimento de tecido e insira a tubulação fMLP. Injete aproximadamente 20 microliters de fMLP no compartimento tecidual para toda a BMFA, deixando aquele tratado com mídia de cultura celular. Corte a tubulação e aperte-a.
Coe a seringa com aproximadamente 200 microliters de suspensão de neutrófilos e monte a seringa na bomba de seringa. Depois de colocar o dispositivo em um estágio de microscópio invertido, defina a taxa de fluxo em um microliter por minuto e inicie a bomba. Espere até que uma pequena gota da suspensão do neutrófilo saia da tubulação e insira a tubulação na porta de entrada.
Neutrófilos fluorescentes fluem para os canais vasculares e interagem com células endoteliais e condições de fluxo fisiologicamente relevantes. Após 10 minutos após o início do experimento, abra o software de análise de imagem, mude a lente objetiva para 10x e use o joystick de palco para centralizar o dispositivo sob o microscópio. Para obter o mapa de adesão, vá para Adquirir, clique em Digitalizar grande imagem.
Uma nova janela aparece. Escolha 10x Lente objetiva e defina a opção de campo, por exemplo, 5 por 3. Clique em Digitalizar, clique em Arquivo e salve o mapa de adesão.
Para obter o mapa de migração para análise de migração, centralizar o dispositivo sob o microscópio usando o joystick de palco. Clique em Exibir, Controles de Aquisição, Aquisição ND. Uma nova janela aparece.
Defina o Caminho para salvar o arquivo e digite o nome do arquivo. Verifique a função Imagem Grande, defina Área de Varredura, por exemplo, 5 por 3. Verifique a função Tempo, defina o intervalo como cinco minutos e a duração em 60 minutos.
Tire imagens de lapso de tempo do compartimento de tecido, com uma imagem tirada a cada cinco minutos durante a próxima hora. A simulação de CFD mostra o padrão de fluxo laminar nos canais vasculares, exceto para áreas de bifurcação onde o padrão de fluxo é perturbado. Após a realização do ensaio biomimético de microfluidos, imagens de contraste de fase revelaram que as superfícies dos canais vasculares foram cobertas com células endoteliais, e alinhadas na direção do fluxo de cisalhamento após 48 horas de cultura.
A imagem de fluorescência foi realizada por meio de microscopia confocal, indicando que as células endoteliais formam um lúmen tridimensional completo no mapa de adesão de neutrófilos bMFA A, que revelou que há uma adesão significativa de neutrófilos às células endoteliais no BMFA. O mapa de migração de neutrófilos na bMFA revelou que, após a ativação TNF-alfa, uma migração considerável de neutrófilos ocorre dentro do compartimento tecidual, enquanto tal migração não foi observada sem ativação TNF-alfa. Um mapa de adesão correlacionando a distribuição espacial de neutrófilos com a taxa de corte demonstrou que a adesão de neutrófilos ocorreu preferencialmente em vasos com baixa taxa de corte e regiões próximas à bifurcação.
Além disso, o tratamento TNF-alfa aumenta significativamente a adesão, que foi inibida com o inibidor delta PKC. Analisar imagens de lapso de tempo indicou que a ativação de células endoteliais aumenta a migração de neutrófilos em resposta ao fMLP, enquanto o tratamento com o inibidor delta PKC reduziu a migração em comparação com células tratadas TNF-alfa. Assim, a BMFA pode ser utilizada para testar a eficácia de um novo terapêutico para o tratamento de doenças inflamatórias.
O bMFA também pode ser usado para estudar a integridade do endotélio medindo variáveis como permeabilidade e resistência elétrica trans-endotelial, o que é chamado de TEER, e expressão de molécula de adesão durante a inflamação. O ensaio microfluido biomimético pode imitar o microambiente de diferentes órgãos e não se limita a tipos ou espécies de células únicas, podendo também modelar a comunicação celular/celular crítica à função do órgão e modelar diferentes doenças.
