Этот подход надежно устанавливает ретроградную перфузию неонатального сердца ex vivo мыши менее чем за три минуты. Таким образом снижается самый младший возможный возраст исследования с нескольких недель до 10 послеродовых дней. Эта изолированная ретроградная перфузированная модель позволяет изучать сердце новорожденных в критический период развития сердца у генетически модифицируемых и недорогих видов.
Пока эта модель поддается изучению физиологических и фармакологических реакций на ишемию-реперфузию в неонатальном сердце. Он также может быть использован для выделения кардиомиоцитов. Чтобы изготовить новорожденную мышь аортальную канюлю, используйте острые ножницы, чтобы отрезать кончик и притупить конец иглы из нержавеющей стали 26 калибра, заботясь о том, чтобы не обжать и не ограничивать диаметр просвета иглы.
Затем разгладьте срезанный край, чтобы удалить любые заусенцы, аккуратно соскребая затупленный конец на лабораторной столешнице с помощью движения туда-сюда. Затем прикрепите изготовленную канюлю к аппарату Лангендорфа и оцените расход и сопротивление. Измерьте скорость потока через канюлю, собирая и измеряя количество буфера в течение одного минутного интервала.
Чтобы количественно оценить перепад давления по канюле во время протекания буфера Кребса-Хенеселейта, измерьте давление в системе с прикрепленной канюлей и без нее. Затем рассчитайте устойчивость канюли, используя следующую формулу. Затем извлеките канюлю 26 калибра из аппарата Лангендорфа и прикрепите трубку высокого давления к месту канюляции на аппарате.
Затем прикрепите канюлю аорты к дистальному концу трубки и де воздух трубки и канюлю с кислородным буфером, гарантируя, что все пузырьки удалены. Чтобы предотвратить образование коронарных микротромбов, введите внутрибрюшинную инъекцию гепарина 10-дневному щенку мыши, используя иглу 26 калибра на одном миллилитре шприца. Дайте несколько минут гепарину циркулировать, прежде чем приступить к инъекции любого анестетика.
Далее поместите обезболенную мышь в лежачее положение и закрепите конечности сразу после потери сознания. Начните сбор урожая, как только животное не реагирует на ущемление пальца ноги, поскольку животное спонтанно дышит во время первоначального рассечения. С помощью прямых рассекающих ножниц делают поперечный подксифоидный разрез по ширине животного, обнажая брюшную полость.
Попросите помощника схватить мечевидный отросток щипцами, затем разрезать грудную клетку двусторонне вдоль средней подмышечной линии в цефаладном направлении и отразить грудину и ребра краниально, чтобы обнажить грудные органы. После того, как диафрагма будет идентифицирована выше, полностью разрезайте переднюю часть. Определите инфрадиафрагматическую нижнюю полую вену над печенью и переведите ее изогнутыми ножницами радужной оболочки, сохраняя при этом незначительное внутреннее напряжение цефалады на проксимальном сегменте с помощью щипцов радужной оболочки.
Затем разрезайте сзади вдоль внутренней поверхности позвоночника с помощью изогнутых ножниц радужной оболочки, одновременно вытягивая нижнюю полую вену вверх и из грудной полости. Когда сердце мобилизуется, наклоните ножницы кпереди и разрежьте большие сосуды, чтобы полностью удалить сердце и легкие. Немедленно погрузите экземпляр в ледяной холод Krebs-Henseleit buffer или saline.
Сердце должно перестать биться в течение нескольких секунд. Поместите лист бумажного полотенца на дно неглубокой чашки Петри, чтобы обеспечить трение для стабилизации сердца во время каннюляции. Смочите бумажное полотенце ледяным буфером Krebs-Henseleit, чтобы сердце не прилипало к нему.
Поместите подготовленную чашку Петри под рассекающий микроскоп и отрегулируйте фокус. Теперь поместите канюлю аорты, прикрепленную к удлинительной трубке высокого давления, под рассекающим микроскопом вместе с шелковым швом 5-0, свободно связанным вокруг ее ступицы. Поместив иссеченные грудные органы в чашку Петри, определите тимус по его белому блеску и двум долям и ориентируйте образец так, чтобы тимус был передним и высшим.
Далее с помощью щипцов тупо отделяют доли тимуса, обнажая большие сосуды. Затем идентифицируйте аорту, обнаруживая отличительные ветвящиеся особенности дуги аорты и трансекцируйте ее прямо проксимально к взлету подключичной артерии с помощью мелких острых ножниц. Теперь аккуратно захватите трансектированную аорту с помощью тонких изогнутых щипцов ювелирного стиля и осторожно канюльируйте аорту тупой иглой 26 калибра, следя за тем, чтобы не повредить аортальный клапан.
Используя тонкие изогнутые щипцы, захватите аорту вокруг канюли и инициируйте ретроградную перфузию, чтобы ограничить ишемическое время. Попросите помощника схватить концы свободно завязанного шва и аккуратно зафиксировать аорту вокруг канюли. Зажмите шов выше или ниже мелко изогнутых щипцов, затем затяните шов и подтвердите адекватность коронарного потока.
Отсоедините трубку высокого давления от аппарата Лангендорфа, схватите ступицу канюли и отсоедините тупую иглу от удлинительной трубки высокого давления. Затем быстро прикрепите ступицу канюли к аппарату. Как только сердце подвешивается на аппарате Лангендорфа в обычном положении, подтверждается адекватная перфузия.
Аккуратно обрежьте легкое, тимус и лишнюю ткань. Затем разрезайте правое предсердие, чтобы позволить стокам коронарных пазух свободно капать. Сделайте небольшой узелок на конце шелкового шва 5-0, затем проткните иглой небольшой кусочек парафиновой пленки и сдвиньте парафин к завязанному концу.
Осторожно пропустите иглу через верхушку желудочка и потяните шов через сердце до тех пор, пока парафиновая пленка не прижмется к боковой стенке желудочка. Пропустите иглу через отверстие заполненной водой согревающей рубашки аппарата Лангендорфа, чтобы сердце можно было обхватить и согреть. Затем прикрепите иглу к датчику силы, избегая капания коронарного синуса.
Отрегулируйте шов, чтобы наложить от одного до двух граммов базального натяжения, как указано в отслеживании диастолического напряжения или надирного намерения. Затем поместите поверхностные электроды на верхний и нижний полюса сердца для записи электрокардиограммы. Наконец, возьмите образец сточных вод коронарных пазух для анализа с использованием внутривенного катетера 24 калибра.
Поверхностные электроды использовались для записи непрерывной электрокардиограммы, что позволило определить внутреннюю скорость и ритм. Все адекватно перфузированные сердца бьются спонтанно в синусовом ритме. Эта стратегия перфузии удовлетворяла метаболические потребности сердца новорожденной мыши, учитывая незначительную выработку лактата и низкий процент экстракции кислорода и потребление глюкозы.
Физиологические переменные средства, такие как среднее денервированное внутреннее сердцебиение и среднее наблюдаемое давление перфузии аорты, также были зарегистрированы и рассчитаны. Некоторые исключающие критерии, такие как время, необходимое для начала реперфузии, продолжительность аритмии и давление перфузии аорты, должны быть рассмотрены для обеспечения согласованности неонатального препарата. После установления перфузии может произойти вмешательство, такое как доставка лекарств, индукция ишемии-реперфузионного повреждения, изменение метаболитов или доставка ферментативных агентов для выделения кардиомиоцитов.
