Знание биодоступности железа имеет важное значение для оценки питательных качеств железа в пищевых продуктах. Биоанализ клеток Caco-2 был разработан для удовлетворения этой критической исследовательской потребности. Этот биоанализ является экономически эффективным и высокопроизводительным подходом для определения биодоступности железа из разных диет.
Он может быть использован для характеристики факторов, влияющих на биодоступность железа, и уточнения целей исследования in vivo. Продемонстрировать процедуру будет Йонгпей Чанг, техник-исследователь из моей лаборатории. Для начала культивируйте клетки Caco-2 в течение 7-10 дней, и как только достаточное количество клеток будет доступно, посейте клетки в колбу без коллагенового покрытия.
Затем выращивайте клетки в колбах в течение семи дней и меняйте среду в другой день. На седьмой день используют клетки для посева многоскважинных пластин. Посейте клетки Caco-2 с плотностью 50 000 клеток на квадратный сантиметр в шести пластинах, покрытых коллагеном.
Добавьте к пластинам DMEM, дополненный HEPES, FBS и 1% антимикотическим раствором антибиотика. Затем инкубировать в течение 12 дней при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. Продолжайте менять среду, по крайней мере, каждые два дня по последовательному ежедневному графику.
Затем готовят минимально необходимую среду, дополненную трубками, антимикотическим раствором антибиотика, гидрокортизоном, инсулином, селеном, трийодтиронином и эпидермальным фактором роста. Замените питательную среду двумя миллилитрами этой подготовленной среды. На следующий день замените его одним миллилитром минимально необходимой среды при рН 7.
Теперь создайте стерилизованное вставное кольцо с использованием силиконового уплотнительного кольца, оснащенного кислотной диализной мембраной. На 13-й день снимите вкладыши из холодильника, слейте воду и замените воду 0,5 молярной соляной кислотой. Оставьте его в ламинарной вытяжке по крайней мере на один час перед использованием.
Затем слейте 0,5 молярной соляной кислоты и промойте стерильной водой объемом 18 мегаом. Хранить в стерильной 18-мегаомной воде в ламинарной вытяжке до готовности к использованию. Создайте двухкамерную систему, вставив кольцо в скважины, содержащее ячейки шестилуночной пластины, а затем верните пластину со вставками в инкубатор.
Для приготовления панкреатин-желчного раствора добавьте 87,5 г слабой катионообменной смолы к солюбилизированному экстракту панкреатина и желчи и используйте шейкер в течение 30 минут при комнатной температуре для смешивания компонентов. Вылейте навозную жижу в большую колонну и слейте ее. Затем центрифугируют элюент колонны.
Взвесьте образец в стерильной 50-миллилитровой центрифужной трубке. Отрегулируйте рН с помощью соляной кислоты и добавьте 10 миллилитров физиологического раствора, содержащего 140 миллимоляров хлорида натрия и пять миллимоляров хлорида калия. Затем устанавливают процесс желудочного сбраживания, добавляя в образец 0,5 миллилитра приготовленного раствора свиного пепсина.
Затем инкубируют на качающемся шейкере в мягкой обстановке в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и инициируют процесс кишечного пищеварения каждого образца, регулируя рН до 5,5-6,0 с 1,0 молярным бикарбонатом натрия. Добавьте 2,5 миллилитра раствора желчи панкреатина в каждую пробирку и отрегулируйте рН до 6,9-7,0 с помощью 1,0 молярного бикарбоната натрия. Используя раствор, содержащий 140 миллимоляров хлорида натрия и пять миллимоляров хлорида калия, добавляют жидкости так, чтобы каждая пробирка содержала ровно 15 граммов общего материала.
Теперь переложите 1,5 миллилитра каждого кишечного переваривания в верхнюю камеру лунки, содержащей клетки Како-2 из шести луночной культуральной пластины. Замените крышку пластины и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе на качающемся шейкере при шести колебаниях в минуту в течение двух часов. Снимите вставное кольцо с дайджестом.
Затем добавьте один миллилитр минимально необходимой среды при рН 7 к каждой лунке и держите пластину обратно в инкубаторе в течение 22 часов. Теперь удалите клеточную культуральную среду и добавьте два миллилитра 18-мегаомной воды в клеточный монослой. Перенесите его на ультразвуковой аппарат и соберите весь клеточный лизат в микроцентрифужные трубки для анализа клеточного белка и клеточного ферритина.
Сорта мантеки показали более высокую доступность железа по сравнению с эталонными контрольными группами белого и красного смоделированных цветов в течение двух последовательных лет сбора урожая. Биодоступность железа из белых и желтых сортов бобов показала увеличение после переработки их в муку. Однако биодоступность железа показала снижение клюквенных, красных почек и черных сортов.
Правильное культивирование монослоя клеток Caco-2 имеет важное значение для успешного использования этого биоанализа. Точное внимание к деталям роста и поддержания является ключом к последовательной реакции биоанализа. Эта модель сводит на нет недостатки и высокую стоимость других подходов и позволяет исследователям выявлять механизмы и более полно оценивать факторы, которые ингибируют и способствуют биодоступности железа.
