Этот метод получает живые ломтики слухового ствола мозга курицы, который охватывает больший градиент частотной области в том же срезе. Эти срезы подходят для электрофизиологических и анатомических экспериментов с большей тонотопической осью. Данная методика поможет понять развитие микросхем в слуховом стволе мозга.
В то время как анатомия специфична для курицы, другие виды птиц, такие как перепела и певчие птицы, имеют аналогичную анатомию. Для начала стерилизуйте яйца 70% этанолом и инкубируйте их при 38 градусах Цельсия и влажности 50%. Затем установите скорость пузырьков для ACSF таким образом, чтобы рН составлял от 7,2 до 7,4 с осмоляльностью от 300 до 310 миллиосмоляров на литр.
Затем смешайте пять граммов агарозы в 100 миллилитрах dACSF. Полностью растворите агарозу с помощью водяной бани или микроволновой печи, пока агароза не начнет бурлить. Перелить расплавленную агарозу в чашку Петри толщиной до пяти миллиметров и держать при комнатной температуре до застывания.
После схватывания запечатайте чашку Петри и храните при четырех градусах Цельсия. Нарежьте агарозу на кубические блоки для использования во время рассечения. Во-первых, очистите область рассечения, используя 70% этанола.
Приклейте опорный или угловой блок агарозы на лоток вибратома. Поместите яйцо под яркий свет и расположите заполненное воздухом пространство на большей или круглой стороне яйца, затем разбейте скорлупу над заполненным воздухом пространством и обнажите мембранный мешок. Сделайте аккуратный разрез в мешочке, чтобы обнажить клюв.
Скальпелем аккуратно вытяните шею и голову из яйца. После обезглавливания очистите голову охлажденным dACSF. Держите голову устойчиво в охлажденном dACSF и сделайте рострокодальный разрез.
Начните разрез сзади и между глазами и следите за длиной собранной шеи. Отделите кожу, чтобы обнажить череп. Вырежьте череп за глазом в среднем и боковом направлении.
Повторите для обоих полушарий. Нарежьте ростральную часть черепа, поместив лезвие за глаза и сделав быстрый разрез. Затем погрузите голову в блюдо с охлажденным dACSF.
Используя пару небольших ножниц, сделайте средние и боковые разрезы в каудальной области черепа, чтобы отделить мозг, не вызывая повреждения тканей. Осторожно обнажите ствол мозга и мозжечок. Втяните спинную область всего черепа.
Удалите ствол мозга и обнажите его мягкой кистью с использованием тонкой кисти. Используйте изогнутые щипцы, чтобы очистить ствол мозга от соединительной ткани и кровеносных сосудов. Отделите ствол мозга от мозжечка, разрезав цветоносы и аккуратно удалив кровеносные сосуды.
Обрежьте ствол мозга дополнительных кровеносных сосудов. Сначала поместите лезвие вибратома вдоль горизонтальной оси. Для корональных ломтиков приклейте ствол мозга на лоток для нарезки ростральной стороной, сохраняя рострокодальную ось вертикальной.
Для сагиттальных срезов держите боковую медиальную ось вертикальной. Для горизонтальных ломтиков склейте вентральную сторону, сохраняя дорсальную вентральную ось вертикальной. Для достижения острой угловатой сагиттальной горизонтальной плоскости приклеивают вентральную сторону ствола мозга так, чтобы вентральная дорсальная ось была вертикальной на гипотенузной поверхности агарозного блока.
Приклейте противоположную поверхность блока агарозы, обращенную к лотку для нарезки, и держите рострокодальную ось параллельно кромке лезвия. В качестве альтернативы нарезке вибратома, погрузите изолированный ствол мозга в агарозу с низкой температурой плавления 4% при 40 градусах Цельсия в чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров. После того, как агароза затвердеет, отрежьте ячейку агарозного блока с помощью острого лезвия бритвы.
Приклейте блок агарозы на его ростральную сторону, сохраняя рострокодальную ось ствола мозга вертикальной. Принимайте корональные ломтики до тех пор, пока не будет видна область NM. Удалите блок агарозы из клея острым лезвием.
Тонкой иглой аккуратно поместите 0,5 микролитра толуидинового синего красителя на NM, чтобы обнаружить ядра. Повторно установите этот блок на лоток для нарезки для сагиттальных или горизонтальных ломтиков. Определите ядра относительно окрашенной области и срезайте ствол мозга.
После секционирования поместите последовательно собранные срезы от 200 до 300 микрон в нарезанную камеру, содержащую ACSF, чтобы уравновесить в течение одного часа при комнатной температуре. Корональные участки ткани ствола мозга от куриного эмбриона E19 до 21 представляют собой относительные изочастотные области слуховых ядер ствола мозга от самой низкой до самой высокой характеристической частотной слуховой области. Были видны афферентные слуховые нервные волокна и бифуркация АКСОНОВ НМ.
Также наблюдалось угловатое ядро. В ростральных отделах верхнее оливарное ядро расположено вдоль вентральной боковой области коронального среза. В сагиттальных срезах были идентифицированы NM и ядро laminaris или NL, где слуховые нервные волокна вошли в кластер нейронов.
Верхнее оливарное ядро было идентифицировано в ростролатеральной области. Были замечены низкие и высокие характеристики частотных слуховых областей от NM и NL вдоль рострокодальной оси. Наиболее медиальный срез показал ипсилатеральные и контралатеральные аксональные пучки и конечную точку слуховой области.
В горизонтальных срезах NM и NL были идентифицированы к средней линии, а нейроны были распределены вдоль боковой медиальной оси. Срезы ткани ствола мозга под острым углом от горизонтальной плоскости показали слуховые ядра ствола мозга через большой диагональный разброс. Увеличенные изображения показали тонотопическую ось слуховых ядер вдоль ростромедиальной до каудолатеральной оси.
Убедитесь, что весь процесс выполняется во льду, охлажденном dACSF, непрерывно пузырится с углеводным кислородом. Этот протокол используется для исследователей, изучающих анатомические и биофизические свойства развивающихся микросхем ствола мозга, в частности, отношения между основными слуховыми ядрами.
