Этот протокол предоставляет пошаговые рекомендации для воспроизводимого пути доступа к областям, представляющим интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Этот метод повышает точность при доставке небольших объемов инъекций в ограниченные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Этот метод был и может быть применен к другим моделям животных.
Доктор Вероника ВандерХорст, адъюнкт-профессор неврологии и главный исследователь лаборатории Вандерхорста, продемонстрирует эту процедуру. Убедитесь, что поток кислорода направлен к носовому конусу. Переместите мышь к стереотаксической рамке и поместите нос в гибкий носовой конус.
Поместите мышь в стереотаксическую рамку, используя только наушники. Нанесите смазку на глаза. Anteroflex головы мыши под углом 90 градусов, вручную направляя нос.
Чтобы закрепить это положение, поместите пластиковый барьер между стойками ушной перекладины адаптера мыши параллельно столбам, при этом плоская часть черепа служит ориентиром. Поместите грелку под мышь и убедитесь, что шея и остальная часть тела расположены параллельно столу, подняв корпус с помощью небольшой коробки. Поместите драпировку под корпус.
Вводят разовую дозу в четыре миллиграмма на килограмм Мелоксикама с медленным высвобождением подкожно при объеме двух микролитров на грамм массы тела. Очистите место хирургического разреза сначала с помощью 70% спиртовой прокладки для приготовления, затем с помощью прокладки для подготовки бетаина, а затем снова с помощью прокладки для подготовки спирта и дайте ей высохнуть. Продезинфицируйте руки и наденьте стерильные перчатки, затем поместите драпировку в месте операции.
Убедитесь, что мышь должным образом обезболена, зажав пальцы ног или проверив рефлекс роговицы. Снижают изофлуран для поддержания уровня 2,0. Сделайте разрез от одного до 1,2 сантиметра хирургическим лезвием 10 от края затылочной кости к плечам одним плавным движением.
Осторожно сделайте разрез в средней линии трапециевидной мышцы, обнажив парные мышцы лонгуса капита. Поместите оба втягивающих крючка между парными мышцами longus capitis, один из которых ориентирован влево, а другой вправо. Используйте тупые щипцы ламинэктомии, чтобы отделить левый и правый живот парной мышцы longus capitis, начиная с затылка, где хорошо видна средняя линия.
Направьте тупые щипцы через кость затылка в средней линии вниз к тому месту, где она встречается с цистерной твердой мозговой оболочки, а затем продолжайте через твердую оболочку к атласу. Переставьте втягивающие устройства и отрегулируйте напряжение, переместив гемостаты. Используйте тупые щипцы ламинэктомии, чтобы разделить мышцы дальше по средней линии, чтобы получить хорошее представление о стволе мозга и мозжечке.
Повторяйте вышеуказанную процедуру по мере необходимости, пока мозжечок и ствол мозга не появятся ниже твердой мозговой оболочки. Используя тупые щипцы ламинэктомии, очистите твердую мозговую оболочку от мелких нитей соединительной ткани, перемещая щипцы от средней линии в боковом направлении до тех пор, пока не появится четкое представление о стволе мозга, создавая больше бокового пространства. Посмотрите на дорсальную поверхность ствола мозга с подробными ориентирами через открытую твердую мозговую оболочку.
Используйте угловые щипцы, чтобы захватить твердую мозговую оболочку, простирающуюся от затылочной кости до атласа, затем используйте пружинные ножницы, чтобы сделать небольшое отверстие примерно от 0,5 до 1,5 миллиметров в твердой мозговой оболочке. Как только твердая мозговая оболочка будет открыта, слейте избыток спинномозговой жидкости стерильным Q-наконечником. Обекс, точка, где центральный канал открывается в четвертый желудочек, является стандартной передне-задней и медиолатеральной нулевой точкой.
Расположите пипетку или шприц к цели с помощью стереотаксического рычага. Опустите плечо дорсала на дорсальную поверхность, которая образуется из дорсовентральной нулевой точки. Затем опустите пипетку на ствол мозга и введите раствор.
Оставьте иглу на месте в течение одной-пяти минут после инъекции, чтобы избежать следа иглы при использовании объемов от трех до 50 нанолитров. Затем поднимите пипетку или шприц с помощью стереотаксического рычага и повторите это для нескольких целей. Осторожно снимите крючки с хирургического поля.
Парные мышцы longus capitis вернутся в нейтральное положение, полностью покрывающее cisterna magna. Не закрывайте трапециевидную мышцу и твердую мозговую оболочку в средней линии, так как они слишком хрупкие, чтобы удерживать швы. Закройте кожу 3 нейлоновыми или полипропиленовыми швами.
Подход cisterna magna позволяет нацеливаться на каудальный ствол мозга и верхние структуры шейного канатика, которые в противном случае трудно достичь с помощью стандартных стереотаксических подходов или склонны к непоследовательному нацеливанию. У мышей такие структуры, как подъязычное ядро, вентральная дыхательная группа и прилегающая ретикулярная формация в хвостовом стволе мозга, обычно нацеливались с использованием подхода cisterna magna, как показано здесь для подъязычного ядра и вентромедиального продолговатого мозга. Чтобы определить точность подхода cisterna magna по сравнению со стандартным подходом, было измерено расстояние между предполагаемыми и фактическими целевыми участками в переднезадней, медиолатеральной и дорсовентральной плоскостях для вентральной и дорсальной областей.
Результаты показывают значительно меньшие погрешности в переднезадней, медиолатеральной и дорсовентральной плоскостях по сравнению со стандартным подходом, подчеркивая повышенную точность подхода cisterna magna для этих целей. При попытке этого протокола важно убедиться, что антерофлексия головы и подъем тела выполняются так, как описано. Затем важно распознать ключевые ориентиры, прежде чем манипулировать мышцей или твердой мозговой оболочкой.
Если эти ориентиры не будут распознаны или если они будут потеряны, будет сложно оставаться ориентированным и выполнять процедуру так, как задумано. Этот метод помог решить концептуальные вопросы, связанные с функциональной анатомической организацией в хвостовом стволе мозга и верхней части шейного канатика.
