Слияние мембран опосредует многие биологические функции. Этот протокол описывает метод обнаружения открытия пор синтеза и динамики высвобождения передатчика и различения трех режимов синтеза: близкого слияния, остаточного слияния и термоядерного синтеза. Комбинация конфокального микроскопа и записи зажимов облегчает визуализацию открытия и замыкания пор слияния и определение их кинетики.
Несмотря на то, что принцип метода описан для хромаффинных клеток, описанный здесь, может быть широко применен ко многим секреторным клеткам далеко за пределами хромаффинных клеток. Успешная реализация этого метода зависит от нескольких общих этапов, таких как генерация здоровой первичной культуры хромаффинных клеток, достаточная эффективность трансфекции плазмид и высокий уровень успеха электрофизиологической регистрации. Выберите три неповрежденные железы без порезов или кровотечений на поверхности и удалите жировую ткань ножницами.
Промыть железы перфузией раствором Локка до тех пор, пока не выйдет кровь. Для пищеварения вводят раствор фермента через надпочечниковую вену, используя 30-миллиметровый шприц, прикрепленный фильтром 0,22 микрометра, пока железа не начнет набухать. Затем оставьте железы при 37 градусах Цельсия на 10 минут.
Снова ввести и оставить железы при 37 градусах Цельсия еще на 10 минут. После пищеварения вырежьте железу продольно от надпочечниковой вены на другой конец ножницами, чтобы развернуть железу. Изолируйте белый продолговатый мозг, вытянув его кусочками в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую раствор Локка.
Нарежьте и измельчите продолговатый мозг ножницами. Отфильтруйте суспензию продолговатого мозга нейлоновой сеткой от 80 до 100 микрометров в стакан. Переложите фильтрат на 50-миллилитровую коническую трубку и центрифугат при комнатной температуре 48 х г в течение трех минут с замедлением на три.
После центрифугирования удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки раствором Локка путем пипетирования. Фильтруйте клеточную суспензию с помощью сетчатого фильтра от 80 до 100 микрометров и центрифугата при комнатной температуре 48 х г в течение трех минут с трех замедлением. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 30 миллилитрами питательной среды.
Определите номер ячейки с помощью счетной камеры гемоцитометра. Переведите 2 800 000 клеток в 15-миллилитровую трубку. Гранулируют ячейки центрифугированием при 48 х г в течение двух минут с замедлением на три.
Добавьте 100 микролитров трансекционного буфера, предоставленного производителем, к грануле ячейки. А затем добавить два микрограмма плазмиды PH-mNG. Аккуратно перемешайте суспензию, положив раствор вверх и вниз, и без задержки перенесите смесь в электропорационную кювету.
Немедленно перенесите кювету на электропоратор, выберите программу 005 в списке экрана и нажмите Enter, чтобы выполнить электропорацию. После электропорации сразу же добавьте в кювету 1,8 миллилитра среды и аккуратно перемешайте с микропипеткой, оснащенной стерильным наконечником. Добавьте 300 микролитров суспензии электропорированных ячеек на крышку в каждой посуде, покрывающей пять-шесть тарелок в общей сложности для одной реакции электропорации.
Аккуратно переложите посуду в увлажненный инкубатор при 37 градусах Цельсия с 9% углекислым газом в течение 30 минут и аккуратно добавьте два миллилитра предварительно приготовленной среды в каждое блюдо через 30 минут. Подготовьте пластырные пипетки из боросиликатных стеклянных капилляров, потянув их с помощью съемника пипетки, покрыв их кончики жидким воском и полировав микроклепкой. Включите усилитель записи патч-зажима и запустите программное обеспечение.
Установите соответствующие параметры записи тока кальция и емкости программного обеспечения. Установите протокол записи продолжительностью 60 секунд в общей сложности, где стимуляция начинается через 10 секунд. Установите удерживающий потенциал для записи зажима напряжения на 80 милливольт.
Установите одну секунду деполяризации с минус 80 милливольт до 10 милливольт в качестве стимула для индуцирования притока кальция и скачка емкости. Включите систему конфокального микроскопа и установите соответствующие параметры в программном обеспечении. Включите лазеры, в том числе 458 нанометров, 514 нанометров и 633 нанометра, и установите диапазон сбора излучения для каждого лазера в соответствии с каждым флуоресцентным зондом.
Выберите блюдо с хорошим состоянием клеток и правильной экспрессией и добавьте два микролитра флуоресцентного ложного нейромедиатора FFN511 в среду в блюде. Поставьте блюдо обратно в инкубатор на 20 минут. После загрузки FFN511 подготовьте записывающую камеру и добавьте два микролитра флуоресцентного красителя А655 в 50 микролитров раствора для ванны.
Переложите крышку с тарелки в камеру записи пинцетом и сразу же добавьте раствор для ванны A655. Поместите каплю масла на цель погружения масла 100X. Установите камеру в микроскоп и используйте регуляторную ручку, чтобы масло просто соприкасалось с нижней частью крышки.
Поместите клетки в фокус и используйте яркое поле и конфокальную визуализацию, чтобы найти подходящую клетку с экспрессией mNG. Увеличьте масштаб выделенной ячейки и расположите ее по центру в поле зрения, свернув пустые области. Задайте параметры для конфокальной визуализации плоскости XY в фиксированной Z-плоскости FFN511, PH-mNG и A665 с минимальным интервалом времени.
Отрегулируйте фокусировку в нижней части ячейки с помощью ручки тонкой регулировки. Отрегулируйте мощность лазера возбуждения в программном обеспечении, чтобы найти настройку, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал/шум и избежать значительного флуоресцентного отбеливания. Добавьте девять микролитров внутреннего раствора в патч-пипетку и прикрепите пипетку к держателю каскада усилителя патч-зажима.
Нанесите небольшое количество положительного давления шприцем и переместите кончик пипетки, чтобы коснуться раствора ванны с помощью микроманипулятора. Убедитесь, что усилитель показывает, что сопротивление пипетки составляет примерно от двух до четырех мегаом с помощью импульсного теста напряжения. Нажмите LJ/Auto, чтобы отменить соединение жидкости.
Переместите пипетку в сторону выбранной ячейки с помощью микроманипулятора. Чтобы сформировать режим прикрепления ячейки, переместите кончик пипетки, чтобы он коснулся ячейки. Измените удерживающий потенциал с нуля до минус 80 милливольт при одновременном применении мягкого отрицательного давления шприцем.
Как только сопротивление пройдет один гигаом, подождите примерно 30 секунд, пока конфигурация стабилизируется. Нажмите C-fast/Auto, чтобы компенсировать быструю емкость. Чтобы сформировать оптовый режим, применяйте короткими, но мощными импульсами отрицательного давления шприцем до тех пор, пока мембрана не разорвется.
Нажмите C-slow/Auto, чтобы компенсировать медленную емкость. Слегка отрегулируйте фокус изображения, чтобы сфокусироваться на нижней части ячейки. Запустите конфокальную покадровую визуализацию и запись патч-зажима одновременно, нажав кнопки Пуск с двумя различными программными приложениями.
После записи убедитесь, что данные сохранены. Измените потенциал удержания до нуля милливольт. Выдвиньте пипетку из раствора ванны и выбросьте ее.
Откройте необработанные файлы образов с помощью любого производителя или поставляемого программного обеспечения. Перейдите в Процесс, нажмите на ProcessTools и используйте инструменты для генерации скользящих средних файлов для каждого изображения таймлапса. Сохраните эти файлы.
В разделе количественной оценки перейдите в Инструменты и нажмите кнопки Stack Profile, чтобы проверить временные точки до и после стимуляции и определить изменения флуоресценции в каждом канале. Нажмите кнопку Нарисовать эллипс, чтобы обвести области, представляющие интерес для событий слияния. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Сохранить ROI для сохранения.
Нажмите кнопку Открыть проекты, чтобы найти необработанный файл. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Загрузить ROI, чтобы загрузить файл ROI в необработанный файл изображения для измерения интенсивности флуоресценции. Перейдите в Инструменты и нажмите «Сортировать ROI» в программном обеспечении и построить трассировки для всех трех каналов каждого ROI.
Щелкните Отчет, чтобы сохранить данные о рентабельности инвестиций, включая цифровые данные и трассировки изображений для каждой окупаемости инвестиций, в папку с файлами. Запись всего клеточного пластыря и применение одной секунды деполяризации от 80 до 10 милливольт было выполнено для вызова экзо и эндоцитоза. Примененная деполяризация индуцировала внутренний ток кальция, скачок емкости, указывающий на экзоцитоз, и распад емкости после прыжка, указывающий на эндоцитоз.
При покадровой визуализации на дне клетки события слияния, индуцированные протоколом деполяризации на одну секунду, были обозначены как снижение FFN, отражающее высвобождение FFN511, сопровождающееся увеличением флуоресценции FPH и A655, отражая диффузию PH-mNG и A655 от плазматической мембраны и раствора ванны в плавящийся пузырь. На рисунке представлено тесное слияние, идентифицированное как затемнение F655, в то время как FPH поддерживался или распадался с задержкой. Рисунок представляет собой слияние пребывания, обнаруженное наличием пятен как PH-mNG, так и A655.
Рисунок представляет собой термоядерный синтез, обнаруженный как параллельный распад FPH и F655, сопровождаемый параллельным уменьшением размера пятна PH-mNG и пятна A655 Успешная запись требует создания всей конфигурации ячейки с патч-зажимом и визуализацией на дне ячейки с надлежащей интенсивностью флуоресценции для каждого канала. Комбинация электрофизиологии и микроскопии сверхвысокого разрешения, описанная здесь, является ценным инструментом для измерения динамики пор слияния и нейросхем.
