Описанный здесь протокол позволяет генерировать случайно мутагенизированные полноразмерные библиотеки РНК вирусных геномов с одноцепочечной положительной РНК длиной до 10 килобайт и выбирать интересующие фенотипы в желаемых экспериментальных условиях. Этот метод позволяет создавать полноразмерные библиотеки вирусных РНК с различными уровнями генетического разнообразия за короткое время, используя подход без клонирования. В методике используются недорогие и широко доступные реагенты для синтеза библиотек.
Эту процедуру продемонстрирует Шахин Хан, докторант отдела вирусологии факультета наук о жизни Университета Шив Надар. Для начала выполните ep-ПЦР, подготовив мастер-микс для четырех серий экспериментов с прямыми и обратными праймерами вместе с компонентами реакции без шаблона pJFH1, как описано в текстовой рукописи. Аликвотный мастер-микс в четыре пробирки.
Добавьте 100 нанограммов, 50 нанограммов, 25 нанограммов и 10 нанограммов шаблона в отдельные пробирки и отрегулируйте общий объем реакции до 50 микролитров. Примените условия цикла, чтобы усилить фрагмент 97 пар из 36 оснований. Оцените продукт ПЦР-ПЦР, амплифицируемый путем загрузки пяти микролитров продуктов ПЦР и сравнения его с известными количествами лестницы ДНК в один килобаз путем проведения электрофореза в агарозном геле на основе 0,8% ТАЕ.
Очистите продукт с помощью набора для очистки колонки. Оцените концентрацию очищенного продукта, измерив абсорбцию на 260 нанометров. Вакуум-концентрат продукта ep-PCR для получения концентрации продукта, равной или превышающей 100 нанограммов на микролитр.
Запустите реакцию синтеза РНК in vitro и поместите ее при температуре 37 градусов Цельсия для инкубации. Затем очистите синтезированный продукт с помощью набора для очистки колонки. Запустите реакцию синтеза кДНК объемом 20 микролитров, добавив примерно один микрограмм вирусной РНК, пять микромолярных обратных праймеров и 200 единиц обратной транскриптазы в соответствии с рекомендациями производителя.
Используя кДНК, приготовьте реакционную смесь, как описано в рукописи, и запустите цикл амплификации. Запустите продукт на 0,8%-ном агарозном геле на основе ТАЕ, чтобы подтвердить размер продукта из 25 пар 71 оснований, а затем очистите продукт с помощью набора для очистки колонки, как показано ранее. Элюют в 40 микролитрах стерильной воды.
Чтобы добавить три основных А-вывеса, добавьте 0,5 микромоляра DATP и одну единицу низкоточной Taq ДНК-полимеразы и инкубируйте весь продукт ПЦР при температуре 70 градусов Цельсия в течение 30 минут вместе с буфером 1X PCR и 1,5 миллимолярным хлоридом магния. Затем очистите смесь с помощью набора для очистки колонны. Наладьте реакцию лигирования, и инкубируйте его при комнатной температуре в течение трех часов.
Затем добавьте 100 микролитров Escherichia coli DH5-Alpha к лигированной ДНК и подвергайте клетки тепловому шоку при температуре 42 градуса Цельсия в течение 35 секунд. Добавьте один миллилитр среды LB в клеточную суспензию и инкубируйте при легком встряхивании в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Центрифуга при 13, 800 RCF.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно взвесьте в 200 микролитрах свежей среды LB. Поместите 100 микролитров трансформированных клеток E.coli DH5-Alpha на планшет LB, содержащий 50 микрограммов ампициллина на миллилитр, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов. Создайте мини-препараты из 25-30 колоний в пяти миллилитрах среды LB, содержащей 50 микрограммов на миллилитр ампициллина, и выращивайте в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.
На следующий день экстрагируют плазмиды с помощью коммерческого набора и проводят расщепление ферментом рестрикции в объеме 10 микролитров с 200 нанограммами выделенных плазмид, двумя единицами EcoR1 и рестрикционным буфером 1X для всех колоний. После инкубации смесей для разложения при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов загружают продукты на 0,8%-ный агарозный гель на основе ТАЕ для подтверждения вставки плазмидной ДНК. Выполнить секвенирование по Сэнгеру плазмид 25 позитивных клонов с использованием рекомендованных праймеров.
За сутки до трансфекции разделите клетки и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра. Затем высейте 7,5 клеток гепатомы человека в 35-миллиметровые чашки в двух миллилитрах полного DMEM и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов в увлажненном инкубаторе с 5%-ным углекислым газом. На следующий день готовят липидный комплекс транскрипта, разводя 10 мкл трансфекционного реагента в 50 мкл минимальной эссенциальной среды, и отдельно разводят пять мкг вирусных транскриптов в 50 мкл минимально необходимой среды.
Выдержите обе смеси при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем смешайте их в одной стерильной микроцентрифужной пробирке и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации клеток извлеките питательную среду, дважды промойте клетки предварительно подогретым 1X PBS и добавьте 1,5 миллилитра минимально необходимой среды.
Медленно добавьте комплекс и аккуратно перемешайте блюдо для равномерного распределения. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным содержанием углекислого газа в течение 10 часов. Затем удалите носитель.
Промойте трансфицированные клетки дважды одним миллилитром, предварительно подогретым 1X PBS, и добавьте два миллилитра полного DMEM. Выделите вирусную РНК из 140 микролитров надосадочной жидкости культуры с помощью набора для выделения вирусной РНК. Организуйте реакцию qRT-PCR объемом 10 микролитров с помощью коммерческого набора для qRT-PCR.
Используйте прямые и обратные праймеры и зонд для количественного определения РНК ВГС. Установите цикл реакции на 48 градусов Цельсия в течение 20 минут, 95 градусов Цельсия в течение 10 минут и 45 циклов по 95 градусов Цельсия в течение 15 секунд и 60 градусов Цельсия в течение одной минуты. Запустите реакции и настройте отрицательный контроль.
Параллельно постройте стандартную кривую, используя десятикратное последовательно разбавленное известное число копий транскриптов ВГС для количественной оценки вирусной РНК. Выполнить в трех экземплярах. Поместите 7,5 клеток человеческой гепатомы в 96-луночную пластину и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5%-ным углекислым газом примерно за 16 часов до добавления вируса.
В шкафу класса биобезопасности II выполните десятикратные последовательные разведения вируса. Добавьте 100 микролитров разбавленного вируса на лунку, чтобы заразить клетки, и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Через трое суток промойте зараженные клетки 0,1 миллилитра PBS, а затем зафиксируйте и пропитайте клетки 0,1 миллилитрами ледяного метанола при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 20 минут.
Промойте лунки 1X PBS трижды, а затем 1X PBST. После удаления ПБСТ заблокируйте клетки на 30 минут при комнатной температуре 0,1 миллилитра 1%БСА, содержащего 0,2% обезжиренного молока в ПБСТ. Удалите блокирующий раствор и обработайте клетки в течение пяти минут 0,1 миллилитрами 3%-ной перекиси водорода, приготовленной в 1X PBS.
Опять же, промойте клетки дважды с помощью 1X PBS и 1X с PBST. Добавьте 50 микролитров моноклонального антитела против NS5A 9E10 в лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте лунки трижды с помощью 1X PBS и один раз с PBST.
Добавьте 50 микролитров конъюгированного козьего антимышиного вторичного IgG HRP на лунку, инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем удалите несвязанное антитело, промыв лунки 0,1 миллилитрами 1X PBS. Добавьте 30 микролитров DAB и инкубируйте планшет при легком покачивании в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите раствор DAB и промойте лунки дважды 1X PBS и один раз дистиллированной водой.
Добавьте 100 микролитров PBS, содержащего 0,03% азида натрия. Исследуйте каждую лунку под микроскопом с инвертированным светом с помощью 10-кратного объектива. Подсчитайте количество положительных скважин.
Используйте калькулятор Рида и Мюнха, чтобы оценить конечную точку разведения, которая заражает 50% лунок. Пибрентасвир, ингибитор NS5A, растворяют в 100% ДМСО до концентрации одного миллимоляра и далее разбавляют его в полном ДМЕМ до концентрации 10 наномоляров. Затем инфицируют наивные клетки Huh-7,5 при 70%-ном слиянии с дозой вируса ML50, чтобы заразить 50% клеток в течение 12 часов, а затем переносят инфицированные клетки на шестилуночные планшеты через 24 часа после заражения.
Добавьте 1X EC50 PIB к инфицированным клеткам через 16 часов после расщепления клеток. Делайте это после каждого расщепления клетки в течение шести последовательных пассажей, за которыми следуют три цикла пассажа без лекарств, и отслеживайте распространение вируса с помощью фокусообразующего анализа. Собирайте вирусные надосадочные жидкости при каждом прохождении и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Извлеките вирусную РНК из надосадочной жидкости на 18-й день и синтезированную кДНК. Амплифицируют ген NS5A, используя пять микролитров разбавленной кДНК. Затем определите мутации лекарственной устойчивости NS5A в шести-восьми положительных бактериальных плазмидах с помощью праймеров секвенирования NS5A.
Полные геномные мутантные библиотеки были синтезированы с использованием клонального pJFH1 в убывающих количествах от 100 до 10 нанограммов. Средний выход продуктов ep-PCR составил от 3,8 до 12,5 нанограмм на микролитр. Доля мутаций в мутантных библиотеках увеличивалась с уменьшением входа pJFH1 в реакцию ep-ПЦР.
ML50, синтезированный с использованием 50 нанограммов матрицы, содержал четыре замены на 10 000 скопированных пар оснований, в то время как ML25, синтезированный с использованием 25 нанограммов матрицы, содержал девять замен. В клональном pJFH1 не было обнаружено замен в количестве секвенированных нуклеотидов. Варианты вируса ML50 были менее восприимчивы к пибрентасвиру по сравнению с клональным вирусом JFH1.
Из восьми клонов NS5A четыре имели комбинацию D7V+F28C, в то время как V8A+F28C и F36L встречались в одном клоне. Эти мутации были обнаружены в N-концевой области NS5A, которая, как известно, содержит клинически значимые мутации резистентности NS5A. Конечная концентрация каждого компонента ep-PCR имеет решающее значение, особенно матричное количество.
Отсутствие KB Extender значительно снизит выход продукта ep-PCR.
