Здесь мы создали простую экспериментальную систему, которая позволяет воссоздать активные комплексы удлинения Pol II, пригодные для исследования функциональной связи транскрипции Pol II и ограничения РНК. С помощью этого метода функциональные удлининные комплексы могут быть легко собраны всего с несколькими компонентами. Удлиненные комплексы обездвижены на магнитных бусинках, поэтому легко изменить условия реакции.
Чтобы обездвижить ДНК-олиго, содержащее биотин на магнитных бусинках, сначала добавьте 200 микролитров магнитных бусин в низко белковый связующий 1,5-миллилитровую трубку, а затем поместите трубку на магнитную стойку на две минуты. В то время как трубка находится на магнитной стойке, используйте пипетку, чтобы удалить жидкость из трубки, не нарушая бисера. Чтобы вымыть бисер, снимите трубку со стойки и добавьте один миллилитр буфера для мытья, содержащего трис-гидрохлорид, ЭДТА и хлорид натрия.
Верните трубку в стойку. Через две минуты снимите раствор для мытья и повторите стирку еще два раза с помощью 200 микролитров одного буфера. Перепродюсните магнитные бусы в 400 микролитров 2X буфера.
Затем добавьте 380 микролитров воды и 20 микролитров 10-микромолярной недатальной биотинилированной ДНК олиго для смешивания. Поместите трубку на нутритор и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого, мыть бисер с обездвиженными не-шаблон ДНК олиго три раза с помощью 200 микролитров буфера, а затем три раза с 200 микролитров хранения и разбавления буфера.
Храните трубку при четырех градусах по Цельсию на ночь, чтобы закончить блокирование бисера с BSA. На следующий день, отбросив раствор, повторно посовестить бисер в 200 микролитров буфера хранения и разбавления, чтобы достичь приблизительной концентрации ДНК в пять микромолеров, а затем перенести раствор с бисером в новую трубку. Для получения дуплекса ДНК-РНК подготовьте 10-микролитровую аннальную смесь в трубке ПЦР с соотношением рЯС-ДНК-ДНК два к одному, как описано в письменном протоколе.
Поместите трубку в тепловой циклер. Установите программу до 45 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем 12 циклов по две минуты каждый, начиная с 43 градусов по Цельсию и снижение температуры на два градуса по Цельсию за цикл. Наконец, держать его без дела при четырех градусах по Цельсию.
Для загрузки очищенной РНК-полимеразы II на гибрид ДНК-РНК смешайте один микролитер дуплекса ДНК-РНК с 13 микролитров свежеприготовленного буфера полимеразы II в трубке. Добавьте один микролитер очищенной РНК-полимеразы II и перемешайте, аккуратно трубя вверх и вниз и помешивая кончиком пипетки, не вводя пузырьков. Инкубировать трубку в течение 10 минут при 30 градусах по Цельсию.
Чтобы завершить удлиненный комплекс, добавьте один микролитер обездвиженных неконфектных олиго-бусин ДНК до 14 микролитров неконфюкерного буфера ДНК, добавьте 15-микролитровую смесь в ранее инкубированную трубку и инкубировать ее еще на 10 минут при 37 градусах Цельсия. Поместите образец на магнитную стойку на две минуты. Вымойте образец один раз с 30 микролитров мыть буфера для удаления неинкорпорированных полимеразы II и oligos.
Чтобы радиолабельировать удлиненные комплексы с РНК 23mers, добавьте один микролитер АТФ и один микролитер радиозапомощенного UTP до 23 микролитров импульсного буфера, и добавьте эту смесь в промытые магнитные бусы для повторного перерасхода. Инкубировать реакцию в течение 10 минут, чтобы синтез radiolabeled 23mers. Добавьте 1,5 микролитров раствора, содержащего 100-микромолерный АТФ и 100-микромолярный UTP микс, в 3,5 микролитров буфера погони и добавьте смесь в трубку, содержащую предварительно собранные удлиненные комплексы на бисере.
Опять же, инкубировать трубку в течение пяти минут, чтобы преследовать все зарождающиеся стенограммы в 23mers. Затем поместите трубку на магнитную стойку и вымойте, как это было сделано ранее, чтобы удалить неинкорпорированные нуклеотиды. Перепродюсатор образца в 30 микролитров буфера для мытья.
Для создания удлиненных комплексов с более длительными транскриптами, следуйте предыдущим процедурам, и масштабировать в четыре раза для создания 120 микролитров промытых удлиненных комплексов для четырех реакций. Этикетка три новые трубы 23mer, 25mer, и 29mer. Перенесите 30 микролитров промытых удлинионных комплексов в 23мерную трубку и добавьте 94 микролитров стоп-микса, содержащего протеиназу K и гликоген.
Поместите трубку, содержащую оставшиеся 90 микролитров промытых удлиненных комплексов, на магнитную стойку на две минуты, удалите супернатант и повторно снимите бисер в 90 микролитров BTB, дополненных 1,2 микролитров АТФ и КТП. Инкубировать в течение 10 минут при 30 градусах по Цельсию. После мытья 90 микролитров буфера стирки перенесите 30 микролитров удлиненных комплексов в 25мерную трубку и добавьте 94 микролитров стоп-микса, содержащего протеиназу K и гликоген.
Опять же, поместите трубку, содержащую оставшиеся 60 микролитров удлиненных комплексов, на магнитную стойку в течение двух минут. Повторите лечение BTB с 60 микролитров буфера дополнены 0,8 микролитров АТФ и CTP. После инкубации и мытья, как это было сделано раньше, повторно помыть образец в 60 микролитров буфера мытья.
Перенесите 30 микролитров из образца в 29мерную трубку и добавьте 94 микролитров стоп-микса, содержащего протеиназу K и гликоген. Проанализируйте реакционной продукции на денатурации полиакриламинидного геля. Во-первых, создать вымытые удлиненные комплексы, содержащие 23mers путем расширения в 13 раз процедуры ранее описанные для получения 390 микролитров для 12 реакций и один дополнительный.
Для выполнения фосфорилирования полимеразы II CTD, удалить супернатант после размещения образца в магнитной стойке, и повторно использовать бисер в 377 микролитров BTB. Этикетка две новые трубки плюс H и минус H.To плюс H, добавить три микролитера транскрипции инициации фактор TFIIH при концентрации 300 нанограмм на микролитер, и до минус H, добавить девять микролитров хранения и разбавления буфера. Добавьте 87 микролитров промытых удлиненных комплексов к трубке plus H и 261 микролитера к минусУ трубки H.
Инкубировать трубки в течение 10 минут, и мыть буфером для мытья. Для выполнения РНК укупорки, добавить 87 микролитров укупорки смеси плюс H трубки и 261 микролитров в минус H трубки для повторного перерасхода. Этикетка четыре новые трубки, пять плюс H, пять минус H, 15 минус H, и 45 минус H, и обойтись три микролитера из пяти, 15 или 45 нанограмм на микролитер укупорки фермента в соответствующие трубки.
Затем подготовь 12 новых трубок с 94 микролитровами стоп-буфера. Начните первую капинговую реакцию, добавив 87 микролитров удлиненного комплекса, обработанных TFIIH, в трубку с надписью 5 плюс H.Incubate при температуре 30 градусов по Цельсию в тепловом блоке. Укупорки реакции должны быть точно приучены с помощью секундомера.
При работе с несколькими реакциями время начала каждой реакции должно быть ошеломлено. После одной, двух или четырех минут, передача 30 микролитров из пяти плюс реакция смеси труб помечены один, два, и три, содержащие 94 микролитров стоп-буфера, чтобы остановить реакции. Продолжить с укупорки реакции для образцов в оставшихся минус H труб точно так же, используя удлиненные комплексы обрабатываются без TFIIH.
Проанализируйте реакционной продукции на денатурации полиакриламинидного геля. Здесь показана диаграмма молекул ДНК и РНК в искусственных удлиненных комплексах. Используя синтетический РНК-олиго из 20 нуклеотидов в качестве грунтовки РНК во время сборки искусственных комплексов удлинения, нуклеотиды были добавлены во время каждого последовательного шага ходьбы протокола для создания 23mer, 25mer, и 29mer.
Сравнивались реакции с использованием РНК-полимеразы II из разных источников. Искусственные удлиненные комплексы были собраны с эндогенной полимеразой дикого типа II, очищенной от крысиной печени или дрожжей деления, и шли для генерации 23mers или 25mers. Анализ был выполнен для измерения укупорки радиозаклеенных транскриптов, связанных с искусственными удлиненными комплексами, содержащими 23 нуклеотидных транскрипта с пятиступным трифосфатным концом.
Последние две полосы показывают продукты реакций, в которых удлиненные комплексы инкубировались с или без укупорки фермента в присутствии TFIIH. Более медленно и более быстро мигрирующие полосы содержат ограниченные и необнаменные стенограммы, соответственно. Первые 12 полос показывают укупорку транскриптов, связанных с удлиненными комплексами с фосфорилированным или нефосфорилированным CTD.
Деятельность полимеразы II и других ферментов может варьироваться от подготовки к подготовке, поэтому необходимо оптимизировать условия реакции путем определения концентрации ферментов для определения оптимального уровня. Важно безопасно использовать радиоактивный материал и избегать загрязнения. Пожалуйста, не забудьте следовать вашим лабораторным и институтом руководящих принципов при проведении экспериментов с радиоактивностью.
