В этом протоколе описываются методы, используемые для производства вируса болезни Ньюкасла, чтобы его можно было безопасно вводить мышам и другим животным, таким как хомяки и овцы. Использование тангенциальной фильтрации потока позволяет обрабатывать большие начальные объемы более эффективно по сравнению с существующими процедурами, в которых используются только процессы центрифугирования. Это длительная процедура, включающая несколько сложных шагов, что означает, что управление временем может быть проблемой.
Я бы рекомендовал определить все потенциальные шаги паузы, чтобы техника могла быть разделена соответствующим образом, минимизируя стресс. Продемонстрировать эту процедуру будет Алекс, научный сотрудник из моей лаборатории. Для очистки от вируса болезни Ньюкасла или NDV, во-первых, запустите ранее установленную экспериментальную систему, запустив через нее 50 миллилитров PBS.
Остановите насос, когда в трубке останется примерно пять миллилитров PBS. Затем прикрепите к трубке фильтр глубины с коэффициентом удержания от одного до трех микромоляров. Чтобы выпустить фильтр, снимите второй колпачок на эпической стороне фильтра глубины, а затем начните запускать дополнительные 50 миллилитров PBS через систему.
Как только PBS начнет проходить через вентиляционное отверстие в верхней части фильтра, закройте порт и продолжайте протекать PBS через линии. После этого замените сосуд для отходов новым стерильным резервуаром для сбора и начните пропускать Allantoic Fluid через фильтр глубины. Затем настройте тангенциальную фильтрацию потока или систему TFF в открытом подтверждении и запустите, как описано в рукописи.
Когда в резервуаре останется около пяти миллилитров жидкости, приостановите насос и добавьте в резервуар отфильтрованную на глубину аллантоидную жидкость. Затем возобновите поток насоса. Чтобы предотвратить сдвиг вируса, важно убедиться, что давление системы не превышает 10 фунтов силы на квадратный дюйм.
Для усиления иллюзии следует использовать комбинацию скорости перистальтического насоса и С-зажима. От 150 до 100 миллилитров аллантойной жидкости оставляют в резервуаре, останавливают насос и обменивают буфер, добавляя от 150 до 200 миллилитров буфера ML. Опять же, приостановите насос, когда в резервуаре останется от пяти до 10 миллилитров жидкости, затем с помощью двух C-зажимов закройте линию талии.
Отсоедините ретнистую линию, подающую резервуар, и вставьте ее в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем возобновить поток и сделать паузу, когда в резервуаре резервуара останется несколько капель жидкости. Затем снимите C-образные зажимы с линий отходов и снова прикрепите сжатую линию подачи к резервуару резервуара.
Между тем, чтобы подготовиться к ультрацентрифугированию градиента плотности йодиксанола, сначала добавьте 0,5 миллилитра 40% йодиксанола к 13,2-миллилитрной трубке с открытой верхней тонкой стенкой ультрацентрифуги. Затем делают колонну готовой с последовательными добавлениями 2,5 миллилитра 20% йодиксанола и 2,5 миллилитра 10% йодиксанола. Перед ультрацентрифугированием осторожно добавляют от шести до 6,5 миллилитров раствора вируса, выделенного из системы TFF, в столб йодиксанола, не нарушая градиент.
После ультрацентрифугирования удалите трубки парой стерильных щипцов. Целевая полоса должна быть большой полосой между 10- и 20%-ными градиентами. Затем подвешивайте трубку над верхней частью стакана, используя подставку для реторты.
После этого прикрепите 1,5-дюймовую иглу 18-го калибра к пятимиллилитровому шприцу, затем проколите иглой боковую часть ультрацентрифужной трубки и удалите целевую полосу, медленно расширив плунжер. После удаления йодиксанола из раствора вируса, как описано в рукописи, используйте шприц для осторожного введения вируса в диализную кассету. Чтобы сконцентрировать раствор вируса, извлеките диализную кассету из диализного буфера и поместите ее в небольшой запечатываемый пластиковый пакет.
Затем добавьте в мешок от 15 до 25 миллилитров 40% полиэтиленгликоля, чтобы диализная кассета была полностью погружена. После диализа ненадолго промойте диализную кассету pBS. Затем наполните воздухом шприц, оснащенный 1,5-дюймовой иглой 18 калибра, вставьте шприц в диализную кассету и нажмите поршень.
Поверните аппарат для удаления вируса, не удаляя ни одного из введенных воздуха. Чтобы выбить остаточный вирус, прилипший к мембране, тщательно массируйте мембрану перчаточными пальцами, не повреждая ее. Чтобы облегчить процесс смещения, удалите часть избыточного воздуха в диализной кассете.
Для анализа контроля качества, во-первых, разбавьте раствор вируса 100 раз, добавив 10 микролитров его к 990 микролитрам PBS в 1,5 миллилитровой пробирке. Затем продолжают последовательное разбавление, добавляя 100 микролитров предыдущего разведения к 900 микролитрам PBS. Для анализа инфекции добавьте 20 микролитров каждого бреда в каждую лунку пластины из 96 лунок.
Прежде чем исследовать цитопатический эффект зеленого флуоресцентного белка или выполнить непрямой иммунофлуоресцентный анализ, инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение не менее 48 часов. С помощью этого протокола был получен высокоочищенный NDV, что было продемонстрировано электрофорезом полиакриламидного геля сульфата натрия вирусных белков. Инфекционность вируса, очищенного этим методом, также была проверена 50% дозой инфекции тканевого культа или анализом TCID50, сделанным в 96 пластинах лунки.
TCID50 определяли по количеству положительных скважин для каждого разбавления с помощью калькулятора Спирмена-Карбера. Анализ инфекции выявил разницу между цитопатическими эффектами лентогенного и мезогенного NDV на клетки DF в разных условиях после 10 и 24 часов инкубации. Иммунофанциальный анализ флоренса также был эффективен при изучении инфекции клеток Vero лентогенным NDV.
При грунтовке экспериментальной системы убедитесь, что линии загрунтованы эффективно, так как любой остаточный гидроксид натрия инактивирует вирус. Также важно поддерживать целостность мембраны, так как нарушение этого значительно ухудшит очистку и выход вируса.
