Добро пожаловать в Институт клеточной биологии и патологии, Николае Симионеску из Бухареста, Румыния. Здесь, в Лаборатории вирусной трансдукции, мы показываем часть производства аденовирусных частиц, используя оптимизированную методологию, основанную на системе AdEasy, разработанной профессором Фогельштейном. Основными этапами технологии производства этого аденовируса являются, во-первых, рекомбинация pAdTrack, содержащая GFP с плазмидой pAdEasy-1 в бактериях BJ5183.
Во-ве, упаковка аденовирусных частиц. В-в-в-ве- усиление аденовируса в клетках AD293. В-четырех, очищение аденовирусных частиц от лисата клеток и среды культуры.
В-пятых, вирусное титровае и функциональное тестирование аденовируса. Здесь мы представляем важный шаг методологии. Очистка аденовирусных частиц из лисата клетки и среды культуры.
Очистка аденовируса начинается с сбора вирусодобывающих клеток и среды. Клетки AD293 были трансфицированы рекомбинантной плазмидой и как аденовирус был упакован. Затем аденовирус усилился последовательными более крупными культурами.
Здесь мы получили 25 пластин T175, и мы начали очистку аденовируса от лицита клетки и среды культуры. Во-первых, мы проверили зеленую флуоресценцию GFP, выраженную трансинпустых клеток. Если клетки все еще прикреплены, мы отсоединим их, нажав на блюдо культуры или с помощью длинного скребка.
Клетки и среда собраны. Колбы промывают PBS, который также собирается в трубках Falcon. Клетки гранулированы центрифугой.
Держите клеточные гранулы, а также среды для дальнейшей очистки аденовируса. На этом этапе, помощь коллеги хорошо ценится для ускорения процесса сбора урожая. Ячейка гранулы зеленый из-за выражения GFP.
Гранулы повторно засасылись в гипертонический буфер Tris, что облегчило бы разрушение клеток. Для клеточного лиза мы используем жидкий азот и сухой газ, прогретый до 37 градусов. Не выполняй более трех циклов, так как вирус будет поврежден.
Для повышения эффективности нарушения работы клеток тщательно проходят клетки гомогенизации через 23 калибровочных шприц иглы. Центрифуга клетки лисировать при 9, 600 х г в течение 12 минут. Перейти супернатант в новых трубках и отказаться от гранул.
Держите супернатант на льду для дальнейшей обработки ультрацентрифугом. Теперь мы обработать культурную среду, чтобы изолировать аденовирус, выпущенный из клеток. Для этого, во-первых, мы взвешиваем необходимое количество сульфата аммония и добавляем его в бутылку, в которой была собрана культурная среда.
Бутылка энергично встряхивается до полного растворения кристаллов. Смесь инкубируется при комнатной температуре в течение двух с половиной часов. Затем суспензия осадка делится на трубки Falcon.
Центрифуга в течение 15 минут при 1600 x г. После центрифугации супернатант отбрасывается, а гранулы повторно засовывляются в 10 миллимолярновом буфере Tris. Если нельзя продолжать очищение аденовируса с помощью ультрацентрифугации, осадок может быть сохранен в течение нескольких дней при четырех градусах, но только после диализа для удаления сульфата аммония.
Здесь мы представили этап диализа. Мы используем шприц, чтобы ввести подвеску в ранее смоченую кассету. Образцы обезличено против 10 миллимолярд tris буфера ночь на четыре градуса.
Заключительный этап очистки представлен ультрацентрифугации шаг на цезий хлорид прерывистый градиент. Чтобы сформировать градиент, во-первых, мы пипетки три миллилитров раствора высокой плотности хлорида цезия. Поверх этого слоя аккуратно залить три миллилитра хлорида цезия низкой плотности.
Подвеска аденовирусных частиц из лисата клетки или среды культуры затем накладывается поверх градиента. Трубы заполнены минеральным маслом и введены в ведра SW41. После равной меры трубки загружаются симметрично в ротор, который вводится в ультрацентрифуг.
Центрифуга работает 35000 об /мин и четыре градуса в течение 18 часов без перерыва. После ультрацентрифугации трубки помещаются на подстажу с черной бумагой сзади, чтобы собрать полосы. Ясная верхняя фаза и клеточный мусор выбрасываются в мусорный контейнер с отбеливающим раствором.
Самая низкая полоса, содержащая полный аденовирус, собирается с наконечником пипетки и собирается в стерильной трубке Эппендорфа. После диализа сахароза добавляется к вирусной суспензии до 4%окончательной концентрации, а вирусные алициты замораживаются при температуре минус 80 градусов. В разделе результатов мы показали экспрессию GFP в клетках, трансуцированных с помощью аденовируса.
Через 48 часов после трансдукции, GFP выражается трансдуцированных клеток, как показано на флуоресценции микроскопии. Процент экспресс-клеток GFP определяется цитометрией потока. Около 50% эндотелиальных клеток человека и крупного рогатого скота, индуцированных 25 единицами трансдукции на клетку, являются положительными GFP.
Такая же урожайность трансдукции была получена для гепатоцитов мурина, когда было использовано всего пять единиц трансдукции на клетку, но это связано с более высокой смертностью из-за чувствительности клеток. Снижение до экспрессии GFP было получено путем трансдукции мезенхимальных стромальных клеток из-за низкой экспрессии специфических рецепторов. Заключительные замечания.
Мы оптимизируем эти трудоемкие технологии, чтобы сократить время, затраты и усилия, необходимые для получения аденовирусных частиц. Подготовленный аденовирус способен инфицировать различные типы клеток и индуцировать экспрессию гена интереса.
