Как клетки поддерживают белковый гомеостаз, не совсем понятно в контексте клеточного стресса и старения. В этом протоколе мы предоставляем простой и точный способ расчета оборота белка, который является ключевым компонентом гомеостаза белка в живых клетках. Pulse SILAC дает экспериментатору возможность измерять оборот белка для отдельных белков и всего протеома с высокой пропускной способностью, которая также более аутентична для биологических систем, чем другие методы.
Принципы этого метода могут быть применены к любой системе, которая может быть метаболически маркирована, включая целые организмы. Этот метод также может привести к пониманию клеточного старения, старения и нейродегенеративных заболеваний. Масс-спектрометрический анализ очень чувствителен к определенным химическим загрязнителям, таким как моющие средства.
Используйте реагенты класса LC-MS на протяжении всей этой процедуры, чтобы обеспечить высококачественный сбор данных. Чтобы начать метаболическую маркировку клеток, замените среду для трех пластин каждой из стареющих и покоящихся клеток 30 миллилитрами среды SILAC Light. Отдельно замените среду для трех стареющих и трех покоящихся пластин на 30 миллилитров SILAC Heavy.
Выращивайте клетки в течение трех дней без изменения среды. Чтобы отделить клетки от культуральных пластин, добавьте пять миллилитров предварительно разогретого трипсинового реагента в каждую пластину и инкубируйте пластины в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Позже повторно суспендируют отсоединенные клетки в пяти миллилитрах той же среды, используемой для культивирования, до общего объема 10 миллилитров.
Затем перенесите клетки на лед и центрифугируйте клетки в 300 раз G при четырех градусах Цельсия. После промывки гранулы дважды, снова раскрутите клетки и удалите супернатант перед повторным использованием гранулы в 150 микролитрах свежеприготовленной восьмимолярной мочевины и 50-миллимолярного буфера лизиса бикарбоната аммония. Перемешайте содержимое трубки путем пипетки вверх и вниз.
Aliquot 50 мкг образца белка попадает в новую пробирку и доводит образцы до равных объемов с буфером лизиса. Затем добавляют дитиотрейтол до конечной концентрации 20-миллимолярной в пробирку и инкубируют образец при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с встряхиванием. Дайте образцу остыть при комнатной температуре в течение 10 минут, прежде чем добавить йодоацетамид до конечной концентрации 40-миллимоляра и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
Затем разбавляют образец до уровня ниже одномолярной мочевины с 50-миллимолярным буфером бикарбоната аммония. Добавьте один микрограмм трипсина на 50 микрограммов исходного белка или при соотношении трипсина к белку 1:50 к образцу. Инкубируйте образец в течение ночи при 37 градусах Цельсия с встряхиванием, чтобы переварить белки в пептиды.
На следующий день добавьте муравьиную кислоту до 1% от объема образца, чтобы погасить переваривание белка. Для очистки образца поместите твердофазный экстракционный картридж на вакуумный коллектор, используя один экстракционный картридж для каждого образца, в соответствии с рекомендациями производителя. После экстракции извлеките образцы пептидов из вакуумного коллектора и полностью высушите их в вакуумном концентраторе.
Сушка занимает около трех часов. Для масс-спектрометрии или анализа MS повторно суспендируют образец пептида в концентрации 400 нанограммов на микролитр в буфере 0,2% муравьиной кислоты. Чтобы повторно растворить пептиды, перемешайте образец в течение пяти минут.
Затем в течение пяти минут настаивайте ультразвуком на водяной бане. Затем центрифугируйте образец, чтобы гранулировать нерастворимые материалы и перенести пептидные супернатанты во флаконы MS. Отправьте образцы для протеомного анализа с использованием жидкостной хроматографической тандемной масс-спектрометрии, или LC-MS-MS.
Используйте настройки, рекомендованные для нецелевого анализа масс-спектрометрией. Загрузите образцы в аналитическую колонну со скоростью потока 400 нанолитров в минуту для элюирования пептидов в течение 90-минутного линейного градиента с использованием смеси органических и неорганических растворителей, причем органический растворитель колеблется от 5 до 35% Получение данных масс-спектрометрических данных в режиме, зависящем от данных, с непрерывным циклом сканирования MS1 с последующим 20 зависящими от данных сканирования MS2 с фрагментацией HCD. Количественная оценка пиковых областей пептидов для тяжелых и легких пептидов в программном инструменте Proteome Quantitation.
Затем экспортируйте тяжелые и легкие пептидные пиковые области. Для расчета периодов полураспада белка откройте книгу анализа SILAC на первом листе под названием Raw Data и вставьте идентификаторы UniProt, названия генов, тяжелые и легкие пиковые области в указанные столбцы. Затем откройте четвертый лист с именем Analysis и удалите строки, в которых столбцы G и H указывают, что образец находится вне диапазона, и сохраните строки, которые читаются в пределах диапазона.
Фенотипы старения были подтверждены с использованием активности бета-галактозидазы, связанной со старением, и анализа RT-qPCR. Для активности бета-галактозидазы стареющие клетки казались синими, в то время как покоящиеся контрольные клетки не имели или имели минимальный цвет. В анализе RT-qPCR стареющие клетки показали более высокие мРНК интерлейкина-6, CXCL8 и CDKN1A-P21 по сравнению с покоящимися клетками.
И наоборот, уровень ламина B1, кодирующего маркер пролиферации, был низким или отсутствовал в стареющих клетках. Извлеченные ионные хроматограммы пептидов выявили относительную пропорцию тяжелых и легких пептидных сигналов. Более низкая доля тяжелых пептидных сигналов по сравнению с легкими стареющими клетками указывала на более медленную скорость оборота белка, а более высокий тяжелый пептидный сигнал по сравнению со светом указывал на более высокую скорость оборота белка.
Немаркированные образцы показали мало или вообще не показали тяжелый пептидный сигнал. Были рассчитаны периоды полураспада для 695 белков, идентифицированных в результате масс-спектрометрического анализа. Период полураспада сообщается как логарифмическое отношение стареющих над покоящимися клетками и строится на графике вулкана.
После расчета скорости оборота белка в стареющих клетках последующий анализ может выявить потенциальные биологические пути, которые регулируются механизмами протеостаза. Pulse SILAC проложил путь для исследователей к изучению динамики белка с беспрецедентной зернистостью и пропускной способностью, что позволило нам изучить изменения в гомеостазе белка во многих отдельных белках.
