Пост-трансляционная модификация белков мелким белковый убиквитин участвует во многих событиях в клетке. Это исследование представляет собой оригинальное дополнение к инструментарию для анализа убиквитинации белка. Мы используем методы обогащения и масс-спектрометрию, чтобы раскрыть глубокий убиквитином.
Мы внесли несколько улучшений в анализ пептидов diGly, которые происходят из убиквитинированных белков. К ним относятся грубая пептидная фракцио орбита до обогащения и применение более продвинутых параметров фрагментации пептидов в Orbitrap. Altogether это приводит к в более большом охвате ubiquitinome.
Некоторые аспекты протокола трудно описать словами. Визуализация некоторых ключевых шагов имеет важное значение для того, чтобы иметь возможность повторить эти анализы различных операторов в другой лаборатории. Процедуру продемонстрирует Карел Безстарости, старший техник в моей лаборатории.
Начните с подготовки культурных клеток или ткани мозга мыши для эксперимента. При работе с клетками, подышать гранулы клеток из одного 150 сантиметров в квадрате культуры пластины в двух миллилитров ледяной, 50 миллимолярной Tris HCL с 0,5% деоксихолата натрия. Отварить лисат при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Затем sonicate его при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. При использовании ткани мозга мыши in vivo вынизывают ее в ледяном буфере, содержащем 100 миллимоляров Tris HCL, 12 миллимоляров деоксихолата натрия и 12 миллимоляров натрия N-lauroylsarcosinate. Sonicate лисировать в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.
Затем варить его в течение пяти минут при 95 градусах по Цельсию. Далее, количественно общее количество белка с помощью калориметрической абсорбции BCA белка анализ комплект, который должен быть по крайней мере несколько миллиграммов для успешного диГли пептид иммунопреципитации. Для экспериментов SILAC смешайте легкие и тяжелые помеченные белки в соотношении один к одному в зависимости от общего количества белка.
Уменьшите все белки с пятью миллимолярами DTT в течение 30 минут при 50 градусах цельсия. А затем алкилат их с 10 миллимолярия иодоацетамида в течение 15 минут в темноте. Затем выполняем переваривание белка с Lys-C в течение четырех часов.
И трипсин пищеварения на ночь при температуре 30 градусов по Цельсию, или при комнатной температуре. На следующий день разделите образец на две миллилитровые трубы Eppendorf и добавьте TFA в переваренный образец до конечной концентрации 0,5%Центрифуга его в 10 000 раз G в течение 10 минут, чтобы осаждать и удалить все моющие средства. Соберите пептид, содержащий супернатант для последующей фракционации.
Используйте высокое рН обратной фазы C18 хроматографии для фракции триптических пептидов. Подготовь пустой шестими миллилитровый колонку картриджа, наполненный 0,5 граммами стационарного фазового материала для около 10 миллиграммов белкового дайджеста. Загрузите пептиды на подготовленную колонку и вымойте ее примерно 10 томами 0,1%TFA, а затем 10 томов воды.
Уполнося пептиды на три фракции, используя 10 объемов столбцов 10 миллимолярия аммония с 7, 13,5 и 50%ацетонитрилом, соответственно. Затем, litholyse все фракции. Одна партия убиквитина остатки мотив антител, конъюгированных с белком агароза шарик суспензии делится на шесть равных фракций.
Растворите три пептидные фракции в соответствии с рукописными указаниями и вращайся вниз по обломкам. Добавьте супернатанты из трех фракций в суспензию из бисера, сохраняя при этом остальные три фракции на льду. И инкубировать их в течение двух часов при четырех градусах по Цельсию на ротаторе.
Затем, спина вниз бисера. Перенесите супернатант на свежую партию бисера. И повторите инкубацию с оставшимися тремя фракциями суспензии бисера.
Храните супернатанты для последующего глобального протеомного анализа. И передать бисер на 200 микролитров пипетки советы оснащены GFF фильтр штепсельной вилкой. Положите кончики в 1,5 миллилитровые трубки, оснащенные адаптером кончика центрифуги, и помойте бисер три раза 200 микролитров ледяного буфера IAP, а затем три моет ледяной очищенной водой.
Спин вниз колонны на 200 раз G в течение двух минут между моет, убедившись, что не дать колонке иссякнуть. После окончательной стирки, elute пептиды с двумя циклами на 50 микролитров 0,15%TFA. Desalt пептиды с C18 этапе кончика и высушить их с вакуумной центрифугации.
Выполните эксперименты LC-MS/MS на чувствительном масс-спектрометре в сочетании с системой nanoflow LC. Колонна настроена в соответствии с рукописными указаниями и хранится на уровне 50 градусов по Цельсию. Эксплуатация масс-спектрометра в режиме получения данных.
Соберите спектры массы MS1 с высоким разрешением с автоматизированной управляемой целью усиления 4E5 и максимальным временем впрыска 50 миллисекунд. Выполните анализ масс-спектрометрии в наиболее интенсивном первом режиме, используя метод наибольшей скорости с общим временем цикла в три секунды. Затем выполните второй раунд анализа DDA MS в наименее интенсивном первом режиме, который обеспечит оптимальное обнаружение пептидов низкого изобилия.
Фильтр ионов-предшественников в соответствии с их состояниями заряда и моноизотопным пиковым назначением. И исключить ранее допрошенных предшественников динамически в течение 60 секунд. Изолировать пептидные прекурсоры с квадрупольным массовым фильтром шириной 1,6 Томсона.
Затем соберите спектры MS2 в ионной ловушке при автоматическом контроле усиления 7E3 с максимальным временем впрыска 50 миллисекунд и энергией столкновения HCD 30%Анализируйте необработанные файлы масс-спектрометрии с помощью соответствующей поисковой системы, такой как свободно доступный набор программного обеспечения Max'u'ut на основе поисковой системы Andromeda. Откройте Max'u'ut и выберите соответствующие необработанные файлы данных. Установите количество процессоров и нажмите на вкладку конкретных параметров группы.
Выберите пищеварение, и позволяют три пропущенных расщепления. Затем выберите модификации и добавьте diGly к переменным изменениям. Выберите вкладку глобальных параметров и добавьте правильную базу данных последовательности белка.
Оставьте другие настройки по умолчанию и нажмите начать выполнять поиск по базе данных. Для количественного анализа файлов экспериментов SILAC установите множественность до двух и выберите тяжелые аминокислотные этикетки. Когда поиск закончен, импортируют текстовые файлы в Персей.
Этот протокол был использован для выявления мест убиквитина в белках из культурных клеток и виво материала путем обнаружения диГли пептидов с нанопоток LC-MS/MS. В существующий протокол было вносясь несколько улучшений, что привело к увеличению числа обнаруженных пептидов диГли. Грубая фракционирование на три фракции была выполнена до иммунопреципиентации.
Одна из фракций содержит собственный K48 модифицированный триптический пептид диГли, который характеризуется широким пиком в хроматограмме LC. Кроме того, режим фрагментации пептидов был скорректирован, чтобы объединить пробеги LC-MS с самыми высокими первыми и самыми низкими режимами первой фрагментации в процедуре анализа данных, которые произвели более 4000 дополнительных уникальных пептидов diGly. Более 23 000 пептидов диГли можно регулярно идентифицировать из одного образца клеток HeLa, обработанных ингибитором протеасомы.
Из всех пептидов diGly, идентифицированных на трех биологических экранах репликации, более 9000 присутствовали во всех трех, в то время как более 17 000 присутствовали по крайней мере в двух из трех репликаций. Количество идентификаций пептидов в значительной степени зависит от количества входного материала. Приблизительное количество идентифицированных пептидов diGly можно ожидать в зависимости от исходного материала, но эти цифры являются лишь оценками, а также будет зависеть от типа используемого масс-спектрометра.
При выполнении этого протокола, предыдущий опыт работы с масс-спектрометрии на основе методов протеомики и обработки и анализа мельчайших объемов выборки, безусловно, было бы выгодно. Программное обеспечение Max'u'ut может быть заменено любым другим алгоритмом поиска базы данных. Также может быть использован другой тип масс-спектрометра.
Результаты с точки зрения пептидной идентификации могут немного отличаться, но это характерно для любой масс-спектрометрии на основе протеомики анализа. Убиквитин имеет важное значение в процессе деградации опосредованного белка, но также играет роль во многих других процессах в клетке. Более глубокое знание убиквитина как пост-трансляционной модификации имеет решающее значение для лучшего понимания его функции.
