Гранулированные гидрогели представляют собой захватывающий новый класс биоматериалов со многими выгодными свойствами. Мы надеемся, что, делясь этими методами, мы сможем расширить доступ и инновации в гранулированных гидрогелях для биомедицинских применений. Этот метод прост, недорог, легко адаптируется ко многим химическим веществам и может быть реализован практически в любой лаборатории.
Загрузите 3-миллилитровый шприц раствором гидрогелевого предшественника. Снимите поршень с задней части пустого 3-миллилитрового шприца и добавьте наконечник крышки в верхнюю часть ствола шприца. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров для переноса раствора предшественника гидрогеля в шприцевую бочку с крышкой наконечника.
Держите шприц-бочку с раствором гидрогелевого предшественника в одной руке, при этом наконечник колпачка обращен вниз, а открытый конец ствола обращен вверх. Верните шприц-плунжер в отверстие задней части ствола шприца. Осторожно протолкните поршень шприца в ствол ровно настолько, чтобы закрыть отверстие в задней части ствола шприца, осторожно удерживая поршень и шприц-бочку вместе, чтобы задняя часть ствола шприца была запечатана плунжером.
Переверните шприц так, чтобы плунжер был обращен вниз, а колпачок наконечника теперь был обращен вверх. Снимите колпачок наконечника и осторожно протолкните поршень в ствол шприца, пока весь воздух не будет удален из шприца. Прикрепите колпачок наконечника к шприцу.
Убедитесь, что раствор предшественника гидрогеля закреплен в 3-миллилитровом шприце с наконечником. Убедитесь, что перед включением ультрафиолетовой лампы принимаются надлежащие средства индивидуальной защиты и средства защиты. Поместите 3-миллилитровый шприц, загруженный раствором предшественника гидрогеля, под лампу УФ-точечного отверждения в течение желаемого периода времени для полного фотосшивания.
Выключите ультрафиолетовую лампу и снимите шприц. Убедитесь, что гидрогель теперь сшит в шприце. Снимите поршень с задней части пустого 3-миллилитрового шприца.
Прикрепите колпачок наконечника к замку luer. Снимите крышку наконечника со шприца, содержащего сшитый сфотографированный объемный гидрогель. Выровняйте верхнюю часть шприца гидрогеля с открытием ствола на пустом шприце.
Выдавливают объемный гидрогель через шприцевое отверстие в ствол пустого шприца. Держите шприц, содержащий экструдированный гидрогель, так, чтобы крышка наконечника была обращена вниз, а отверстие ствола было обращено вверх. Используя пипетку объемом 1000 микролитров, добавьте 1,5 микролитра PBS в ствол шприца.
Выровняйте шприц-плунжер с отверстием ствола, едва вдавливая плунжер достаточно, чтобы создать уплотнение. Переверните шприц таким образом, чтобы плунжер теперь был обращен вниз, а крышка наконечника была обращена вверх, убедившись, что плунжер и шприц-ствол находятся вместе, чтобы не просачивались гидрогель или PBS. Инвертировать несколько раз, чтобы смешать фрагментированный гидрогель с добавленным PBS.
Держите шприц так, чтобы колпачок наконечника был обращен вверх, а плунжер был обращен вниз. Снимите колпачок наконечника. Очень осторожно, нажмите плунжер вверх, чтобы удалить воздух из внутренней части шприца.
Экструдируют фрагментированный раствор гидрогеля через ряд игл для создания фрагментированных микрогелей. Прикрепите тупой наконечник иглы 18-го калибра к верхней части шприца, содержащей фрагментированный гидрогель и PBS. Извлеките поршень из свежего 3-миллилитрового шприца и прикрепите крышку наконечника к пустому стволу шприца.
Экструдируйте фрагментированный раствор гидрогеля через иглу 18-го калибра в заднюю часть пустого ствола шприца. Выбросьте пустой шприц и иглу в соответствующий поток отходов острых предметов. Повторите экструзию раствора гидрогеля иглой 23, 27 и 30 калибра.
На последнем этапе экструзии экструдируют фрагментированный раствор микрогеля в микроцентрифужные трубки. Промыть и изолировать фрагментированную микрогелевую суспензию. Используя микроцентрифугу, распустите фрагментированный раствор микрогеля в 5 000 раз в течение 5 минут.
Используйте пипетку, чтобы удалить супернатант. Добавьте 1 миллилитр PBS в каждую микроцентрифужную трубку, содержащую фрагментированные микрогели и вихрь в течение 5-10 секунд. Объедините 20 микролитров фрагментированной микрогелевой суспензии со 180 микролитрами PBS для создания разбавленной фрагментированной микрогелевой суспензии.
Вихрь тщательно перемешать. Переложите 50 микролитров разбавленной фрагментированной микрогелевой суспензии на предметное стекло микроскопа. Используйте эпифлуоресцентный микроскоп для получения изображений флуоресцентно меченых микрогелей с 4-кратным или 10-кратным зумом.
Глушить фрагментированные микрогели с помощью вакуумной фильтрации. Соберите и протестируйте фильтрационный аппарат с вакуумным приводом. Закрепите воронку Бюхнера внутри колбы фильтра.
Используйте трубку для подключения колбы фильтра к вакуумной линии. Поместите мембранный фильтр в воронкообразную чашку Бакнера. Включите вакуумную линию, открыв циферблатный клапан.
Проверьте соединение путем пипетки примерно 0,5 миллилитра PBS на мембранный фильтр и обратите внимание, что все PBS проходит через фильтр и собирается в нижней части колбы фильтра. Включив вакуумную линию и обеспечив полное уплотнение, вихрьте фрагментированный раствор микрогеля. Используя пипетку объемом 1000 микролитров, перенесите фрагментированный раствор микрогеля на мембранный фильтр.
Подождите примерно 30 секунд, пока вакуум вытащит PBS из раствора микрогеля. Выключите вакуумную линию. Возьмите свежий шприц объемом 3 миллилитра и извлеките поршень.
Используйте металлический шпатель, чтобы зачерпнуть фрагментированный гранулированный гидрогель из фильтра и перенести его в заднюю часть пустого шприцевого ствола. Верните поршень в шприц. Загрузите фрагментированный гранулированный гидрогель в шприц, и теперь он готов к использованию.
Снимите колпачок наконечника и замените его иглой по выбору. Загрузите шприц в выбранную платформу для печати. Загрузите подготовленный файл G-кода с этапа планирования в программное обеспечение для 3D-печати.
Перейдите на панель «Предварительный просмотр» и нажмите кнопку Печать. Как только печатное осаждение будет завершено, подвергайте фрагментированные гранулированные гидрогелевые конструкции ультрафиолетовому свету для фотосшивания и стабилизации. Экструзионная фрагментация дает микрогели с зубчатыми полигональными формами диаметром от 10 до 300 микрометров.
Цикличность колеблется от 0,2 до почти 1, а соотношение сторон колеблется от 1 до 3. Эти параметры описывают неправильные и зубчатые формы микрогелей, образованные процессом фрагментации. При упаковке с использованием центрифугирования или фильтрации с вакуумным приводом собранный гранулированный гидрогель разжижается и самовосстанавливается.
Фрагментированный гранулированный гидрогель обладает высокой точностью формы и механической целостностью для инъекционного гидрогеля. В дополнение к использованию фрагментированных гранулированных гидрогелей для 3D-печати, эти системы также могут использоваться в качестве платформ для культивирования клеток in vitro, а также инъекционных систем для восстановления тканей и доставки лекарств. Эти простые и недорогие методы приносят преимущества гранулированных гидрогелевых биоматериалов большему количеству исследователей, что позволяет расширить доступ к производству гранулированного гидрогеля, а также инновациям в области биоматериалов.
