Гранулированные материалы, такие как каркасы MAP, представляют собой пористые инъекционные материалы, изготовленные из взаимосвязанных микроразмерных частиц гидрогеля. Контроль фракции частиц имеет решающее значение для свойств материала и клеточных реакций. Переменные фракции частиц в каркасах MAP приводят к диапазону свойств каркаса и откликов ячеек, но этот метод позволяет пользователям определять конечную фракцию частиц в создаваемых ими каркасах MAP.
Каркасы MAP могут использоваться для содействия восстановлению и регенерации сложных ран, а также для доставки лекарств. Фракция частиц, например, влияет на скорость и степень клеточной инфильтрации и регенерации. Этот метод может быть применен ко всем классам гранулированных гидрогелей.
Теперь, когда мы можем создавать каркасы MAP с контролируемыми пользователем фракциями частиц, мы можем воспроизводимо изучать биологическую активность этих материалов и исследовать уникальные реакции клеток, такие как удержание. Настройка генерации микрофлюидных микрогелей требует времени и терпения по мере изучения методов. Лучше всего подготовить и подготовить несколько устройств на случай, если у вас возникнут проблемы с настройкой.
Начните с микрофлюидной продукции гиалуроновой кислоты, или ГК, и норборнена, или NB, микрогелей. Перед сушкой микрогелей взвесьте криобезопасную трубку с винтовой крышкой. Затем в стерильной вытяжке перенесите промытые и очищенные микрогели в криобезопасную трубку с винтовой крышкой с помощью пипетки с положительным смещением.
Добавьте 70% этанол в очищенные микрогели и хорошо перемешайте. Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут по 5 000 г. Аспирировать супернатант и добавить 70% этанола.
Хорошо перемешать и инкубировать в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день ненадолго центрифугируйте, чтобы микрогели находились в нижней части трубки. Добавьте жидкий азот в криогенный контейнер и поместите трубку с микрогелями для мгновенной заморозки.
Через пять - 10 минут удалите пробирку с микрогелями с щипцами. Быстро снимите колпачок и накройте трубку лабораторной тканью. Закрепите ткань резинкой и перенесите ее в контейнер для лиофилизации или камеру.
Загрузите образец на лиофилизатор, следуя инструкциям производителя, и лиофилизируйте при 0,066 Торр и минус 63 градусах Цельсия. Взвесьте лиофилизированные микрогели из пробирки, прежде чем хранить их при комнатной температуре. Смешайте полидиметилсилоксан или эластомерное основание PDMS с отверждающим агентом в соотношении 10 к одному по массе.
Налейте смесь PDMS в большую пластиковую чашку Петри и дегазируйте в осушителе в течение 30 минут или до тех пор, пока все пузырьки не исчезнут. Как только все пузырьки исчезнут, аккуратно поместите 3D-печатную форму в PDMS, чтобы свести к минимуму образование новых пузырьков. Поместите в духовку при температуре 60 градусов Цельсия на два часа, чтобы вылечить PDMS.
После отверждения используйте нож или лезвие бритвы, чтобы аккуратно проследить по периметру культурального устройства и аккуратно удалить плесень. Используйте четырехмиллиметровый биопсийный перфоратор, чтобы удалить любую PDMS со дна скважин. Вырежьте устройства, чтобы они поместились на стеклянной крышке.
Используйте ленту для удаления пыли с нижней стороны устройства для культивирования. Поместите чистую стеклянную крышку и устройство для культивирования на конфорку при температуре 135 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы удалить влагу. В вытяжном капюшоне используйте коронный плазменный пистолет высоко на стеклянной крышке и нижней стороне устройства в течение 30 секунд.
Затем быстро склейте обработанные поверхности вместе. Осторожно надавите, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между устройством для культивирования и проскальзыванием стеклянной крышки. Поместите устройство в духовку с температурой 60 градусов Цельсия на ночь, чтобы закрепить связь.
На следующий день автоклавируйте устройство для стерилизации перед использованием in vitro. Затем подготовьте микропористую отожженную частицу, или компоненты каркаса MAP, на основе желаемой фракции частиц для клеточной культуры в каркасах MAP. Взвешивают лиофилизированные микрогели для определения массы микрогелей.
Затем восстанавливают микрогели в 84% конечного объема MAP клеточных сред на основе выбранного весового процента MAP. Дайте микрогелям набухнуть в течение 20 минут. Растворяют гиалуроновую кислоту, или ГК-тетразин, и клеточные среды в 16% конечного объема MAP.
Как только клетки достигнут желаемого слияния, поднимите и подсчитайте клетки. Перенесите 10 000 ячеек на микролитр MAP в новую трубку. Центрифугируйте клетки и аспирируйте супернатант из гранулы, не аспирируя клетки.
Добавьте микрогели и поперечный компоновщик в гранулу с помощью вытесняющей пипетки. Хорошо перемешать, и посеять по 10 микролитров на лунку. Пипетка круговыми движениями равномерно распределит смесь в лунке.
Дайте микрогелям отжигнуть при 37 градусах Цельсия в течение 25 минут, прежде чем добавлять клеточную среду для заполнения лунок. Поддерживайте 3D-культуры при температуре 37 градусов по Цельсию и меняйте медиа по мере необходимости. Чтобы избежать аспирации леса, стабилизируйте кончик пипетки вдоль гребня верхнего колодца.
В нужные моменты времени фиксируйте образцы, заменяя среду 50 микролитрами 4% параформальдегида на скважину в течение 30 минут при комнатной температуре. Промыть образцы три раза 50 микролитрами PBS, или предпочтительным буфером, и приступить к иммунофлуоресценции или флуоресцентному окрашиванию с использованием 50 микролитров на скважину в качестве рабочего объема. Было показано, что микрофлюидные устройства с областью, фокусирующей поток, производят микрогели HA-NB диаметром 50 или 100 микрон.
Среда для лиофилизации микрогелей была оптимизирована для минимизации образования криогеля с использованием 70% этанола. Однако другие среды, такие как изопропиловый спирт, вода и ацетонитрил, могут использоваться взаимозаменяемо для облегчения образования криогеля. Для облегчения биоортогональной взаимосвязи микрогелей HA-NB синтезирован линейный сшивающий ГК-тетразин.
Протонная ЯМР-спектроскопия показывает успешную модификацию 11% единиц повтора ГК с тетразиновой подвесной группой. Высушенный лиофилизированный микрогелевой продукт регидратировали специальными объемами и отжигали для достижения различных весовых процентов составов микрогелей в каркасах MAP. Эти весовые проценты микрогелей в каркасах MAP соответствовали уникальным фракциям частиц.
Клеточная культура в каркасах MAP показана здесь. Клетки в 3D-культуре в каркасах MAP были зафиксированы на пятый день, окрашены и изображены на конфокальном микроскопе. Одиночные Z-срезы показывают различия в росте клеток и каркасах, включающих разные весовые проценты MAP.
Выберите среду лиофилизации соответствующим образом в зависимости от того, хотите ли вы криогели или нет. Не пропускайте этапы инкубации, чтобы ваши микрогели имели достаточно времени для разбухания в среде. Стандартные методы, такие как микроскопия, проточная цитометрия, секвенирование РНК и многое другое, могут быть использованы для оценки клеточных реакций в этих гранулированных материалах с определенной пористостью.
