Возраст, инфекция и ототоксические препараты могут вызвать дегенерацию волосковых клеток внутреннего уха, что у нас приводит к потере слуха. У позвоночных, не являющихся млекопитающими, таких как цыпленок, волосковые клетки могут быть регенерированы. Методы, описанные здесь, используют экономическую эффективность работы с эмбрионами цыплят, простоту получения эмбрионов и хорошее экзоразвитие тканевых эксплантов.
Понимание развития и регенерации волос птичьего внутреннего уха может дать важную информацию о потере слуха и потенциальных методах лечения, а эксплантная культура может быть важна для оценки ототоксических эффектов различных лекарств. Перед началом эксперимента заготовьте свежеотложенные яйца и очистите их 70% этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. Инкубировать яйца в течение 3,5-4 дней, при температуре от 37 до 38 градусов цельсия при влажности 45%.
После инкубации переместите эмбрион в верхнюю часть желтка, положив яйцо на бок на пять минут. Затем используйте щипцы, чтобы сделать небольшое отверстие в верхней части и тупой конец яйца для прохождения иглы 21 калибра. Используя пятимиллилитровой шприц и иглу 21 калибра, удалите два миллилитра альбумина из отверстия на тупом конце яйца.
Закройте отверстие на тупом конце с помощью прозрачной ленты. Для изготовления яичного окна прикрепите прозрачную ленту к верхней части яичной скорлупы. Удерживайте иглы от микроинъекции из стандартных стеклянных капилляров с помощью вертикального съемника пипетки.
После вытягивания отломите наконечник капилляра с помощью тонких щипцов, чтобы получить диаметр наконечника примерно 50 микрометров с коническим концом. Для эксперимента по нокауту генов смешайте три конструкции, а именно направляющую плазмиду, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP в соотношении один к одному с одним микрограммом белка SP Cas9, 30% сахарозы и 0,1% быстрого зеленого красителя и конечным объемом 10 микролитров. При электропорации нескольких плазмид убедитесь, что конечная концентрация ДНК составляет не менее четырех микрограммов на микролитр.
С помощью пружинных ножниц разрезают около двух сантиметров в длину и 1,5 сантиметра в ширину окна, и обнажают эмбрион. Затем используйте щипцы, чтобы открыть хорионические мембраны, покрывающие эмбрион, обеспечивая доступ к эмбриону. Введите около 200 нанолитров объема смеси раствора ДНК, чтобы заполнить отический пузырь.
Для определения эффективности направляющей РНК проводят эндонуклеазный анализ Т7. Добавьте 0,719% солевых капель к эмбриону, чтобы снизить электрическое сопротивление и предотвратить перегрев. Далее поместите положительный электрод через отверстие, сделанное на тупой стороне яйца, и маневрируйте электродом так, чтобы он находился под желтком.
Поместите отрицательный электрод над заполненной отоцистой. Чтобы трансфектировать плазмиду в отический пузырь с помощью электропорации, используйте генератор квадратных импульсов и примените пять импульсов по 25 вольт в течение 100 миллисекунд каждый, с интервалом 50 миллисекунд. Определите условия эмпирически на основе индивидуальной электропорации.
После электропорации увлажняют эмбрион, добавляя несколько капель 0,719% физиологического раствора. Повторно запечатайте яйцо прозрачной лентой и верните в увлажненный инкубатор при температуре от 37 до 38 градусов Цельсия для дальнейшей инкубации. Продезинфицируйте хирургический стол, стадию микроскопа и прилегающую область, используя 70% этанола и тепла, или спирт стерилизует оборудование для микродиссекции, включая ножницы с минимальным пружинным луком, микрокют и две пары тонких щипцов.
Приготовьте пластины для рассечения, включая стеклянную чашку Петри с черной силиконовой основой, 90-миллиметровую пластиковую чашку Петри и 60-миллиметровую чашку Петри. Держите охлажденный PBS или сбалансированный раствор соли Хэнкса, также известный как HBSS, готовым к рассечению. Аккуратно разбейте яйцо в 90-миллиметровую чашку Петри.
Затем определите наружное ухо цыпленка и перенесите голову на 60-миллиметровую чашку Петри, наполненную ледяным холодом PBS. Затем сориентируйте эмбрион верхней частью клюва внутрь и удерживайте клюв с помощью одного из щипцов числа пять. Вычерпывайте глаза, используя щипцы второго номера пять.
Затем, от рострального до каудального, разрезайте вдоль черепа вдоль его средней линии и вычерпните мозг. Добавьте больше ледяного PBS, или HBSS, и найдите два отолита лагены в виде блестящих структур в конце кохлеарного протока и близко к средней линии. Чтобы изолировать два внутренних уха, прорежьте между двумя лагенами, а также значительно выше и ниже области.
Затем под косым освещением визуализируют контур внутреннего уха, и удаляют посторонние ткани и преддверие. Переложите изолированную улитку на черную силиконовую опорную пластину с ледяным холодом PBS. Очистите хрящевую кохлеарную капсулу, используя щипцы номер пять, чтобы получить кохлеарный проток.
Затем найдите волнистый слой или тегментум кохлеарного протока и удалите его, используя щипцы no 55, чтобы обнажить базилярный сосочек или АД. Затем удалите текториальную мембрану, чтобы обнажить волосковые клетки и поддерживающие клетки, используя щипцы no 55. Для мембранной культуры базилярного сосочка берут шестилуночную тканевую культуральную пластину и устраивают одну культуральную мембранную вставку на каждую лунку. Нарисуйте некоторые среды в пипетке объемом 200 микролитров, а затем аспирируйте рассеченный базилярный сосочковый эксплант одним буфером X HBSS.
Перенесите эксплант на мембрану и сориентируйте его так, чтобы базилярный сосочек был обращен вверх, а волос и опорные клетки были видны сверху. Как только эксплант позиционируется, аспирируйте буфер HBSS медленно с поверхности культуральной мембраны. В этом процессе эксплант будет прикрепляться к культуральной мембране.
Заполните колодец шестилуночной пластины, добавив 1,2 миллилитра модифицированной орлиной среды дульбекко, или культуральной среды DMEM, между мембранной вставкой и стенкой скважины. Для приготовления коллагеновой культуры кохлеарного протока добавляют три капли свежеприготовленной коллагеновой смеси в каждую лунку из четырех лунок и переносят рассеченный кохлеарный проток в каждую каплю коллагена. Инкубируйте пластину в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы вылечить коллагеновую матрицу.
Для обработки культур с малыми молекулами замените питательные среды 700 микролитрами среды, дополненной фармакологическим модулятором, таким как пенициллин, и инкубируйте пластины, как было продемонстрировано ранее. Заменяйте 50% питательных сред каждый день. После соответствующего времени инкубации удалите питательные среды и используйте экспланты для последующих анализов.
В электропорационной установке правильное позиционирование электрода приводило к более высокой экспрессии GFP во внутреннем ухе в обоих вестибулярных органах, а слуховой базилярный сосочек подтверждал трансфекцию. CRISPR Cas9 опосредовал нокаут гена Atoh1 во внутреннем ухе, что привело к потере волосковых клеток. Нокаут гена Atoh1 с помощью ово-электропорации с последующей инкубацией до тех пор, пока E10 не показал снижение развития волосковых клеток по сравнению с контролем пустой плазмиды.
Хотя электропорация является мозаичной, контрольные электропорированные клетки смогли сформировать волосковые клетки. В электропорированных образцах гРНК Atoh1 зеленые флуоресцентные белковые положительные клетки никогда не показывали маркеров развития волосковых клеток. Органная культура базилярного сосочки в 3D-матрице, такая как коллаген и пятно с антителами против антигена волосковых клеток, обеспечили отличное сохранение морфологии тканей на срок до пяти дней.
Организация волосковых клеток и поддерживающих клеток поддерживалась в этих условиях культивирования. Культуры органов на мембране могут сохраняться до пяти дней, сохраняя при этом целостность пучка волос. Это можно увидеть на репрезентативном изображении по локализации белка наконечника звена, протокадгерина 15.
Для исследования развития пучка волос изображения с более высоким разрешением, такие как микроскопия сверхвысокого разрешения или сканирующая электронная микроскопия, могут предоставить больше информации. Стерильные условия должны поддерживаться на протяжении всей процедуры. Во время электропорации следите за тем, чтобы эмбрионы не высыхали.
При титровании фармакологических ингибиторов можно снизить концентрацию, чтобы преодолеть любую летальность. Как эмбрионы, так и экспланты могут быть взяты для экспериментов по визуализации. Либо путем выполнения микроскопирования видео в реальном времени, либо путем статического конфокального электронного микроскопирования, как показано в протоколе.
Учитывая простоту и доступность использования эксплантов внутреннего уха цыплят, мы можем использовать среду с помощью скрининга доказательств для выявления новых молекул, необходимых для регенерации волосковых клеток.
