Прививка на ранней стадии посева является мощным инструментом для постановки сигнализации на большие расстояния у растений. Мы надеемся, что этот метод поможет в успешном внедрении посевной прививки без практического обучения. Начните с подготовки квадратной чашки Петри размером 100х100 миллиметров для отливки силиконового эластомера.
Возьмите проволоку 29 калибра в скрутке стяжки, предварительно удалив внешнее бумажное покрытие на проводе ацетоном. И полностью выпрямить проволоку, прокатав ее по твердой однородной поверхности тяжелым плоским предметом, например, металлической трубчатой стойкой. Затем положите четыре куска выпрямленных проводов, равноудаленных друг от друга, в квадратную чашку Петри, убедившись, что провода лежат ровно на дне чашки.
Налейте смешанный раствор кремниевого эластомера поверх проводов в чашке Петри и накройте чашку крышкой. После того, как силикон затвердеет в течение 24–48 часов при комнатной температуре, снимите силиконовый лист с чашки Петри с помощью чистых щипцов и переместите его на чистую плоскую поверхность. Снимите провода с силиконового листа.
Чтобы убедиться, что каналы открыты с одной стороны, используйте тонкие щипцы, чтобы очистить тонкий слой силикона, блокирующий открытую сторону каналов. Разрежьте лист силикона перпендикулярно каналам на трехмиллиметровые полоски с помощью чистых ножниц. Поместите каждую полоску в конверт из алюминиевой фольги и заклейте его автоклавной лентой.
Автоклавируйте полоски при температуре 121 градус Цельсия не менее 30 минут, прежде чем хранить их до тех пор, пока они не потребуются. Чтобы стерилизовать и яровизировать семена, возьмите один миллилитр 50%-ного раствора отбеливателя, содержащего 0,1%Tween 20, в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку и суспендируйте в ней до 100 семян арабидопсиса. Инкубируйте семенную суспензию при комнатной температуре от пяти до 10 минут.
После инкубации аспирируйте или пипетку раствор отбеливателя в стерильных условиях. Промойте семена одним миллилитром стерилизованной дистиллированной воды. Обязательно достаточно инвертируйте трубочки при промывании семян.
Чтобы удалить раствор отбеливателя, оставшийся в верхней части тюбика, повторите полоскание четыре раза. Оставьте примерно 250 микролитров воды с семенами в пробирке и храните семена в темноте при четырех градусах Цельсия в течение трех дней. Затем, прежде чем покрывать семена, поместите стерильные полоски на поверхность подготовленной пластины MS, чтобы направить выравнивание семян с каналами на полосках.
Затем, работая в стерильных условиях, используйте наконечник пипетки объемом 20 микролитров для аспирации и переноса соответствующего количества подготовленных семян на тарелку. Как только семена будут покрыты пластиной, удалите стерильные полоски. Накройте тарелку.
И заклейте одну из сторон пластины параллельно рядам семян парапленкой. Оберните дышащую ленту поверх парапленки и вокруг всех остальных краев пластины, чтобы обеспечить воздухообмен во время инкубации. Осторожно расположите две пластины вертикально сторонами, запечатанными парапленкой, вниз.
Разделите их внизу, горизонтально поместив между ними 15-миллилитровую центрифужную трубку, закрепив их сверху резинкой. Убедитесь, что поверхности пластин образуют угол от 100 до 110 с поверхностью столешницы. Храните пластины в этой ориентации в течение 72 часов в полной темноте при температуре 21 градус по Цельсию, чтобы гипокотиль рассады выросли примерно на пять миллиметров в длину.
После этого извлеките установку из темноты и держите ее под 16-часовым светлым и восьмичасовым темным циклом в течение двух-четырех дней при той же температуре перед прививкой. Прививайте саженцы через пять-семь дней после облицовки. Поместите прививочную полосу поверх саженцев, вставив их гипокотили в каналы.
Аккуратно расположите саженец так, чтобы соединение корня и гипокотила оставалось в нижней части силиконовой полоски, чтобы подготовить саженец к срезке. Работая в стерильном капюшоне с помощью диссекционного прицела, подготавливают отпрыски к прививке. Используя свежее лезвие скальпеля, сделайте прямой, чистый, перпендикулярный разрез поперек гипокотиля.
Не придавливайте и не вдавливайте саженец в агар. Затем снимите желоб и держите отрезанную часть желоба гидратированной, обеспечив контакт с поверхностью среды. В качестве альтернативы желоб можно переместить в чашку Петри, заполненную стерильной дистиллированной водой.
Чтобы подготовить подвои, осторожно возьмитесь за корень в пространстве между закрытыми щипцами и осторожно поверните, чтобы потянуть его, оставив срезанный участок подвоя в середине полосы. Затем аккуратно поднимите нужный желоб с помощью щипцов с тонким наконечником и вставьте его в верхнюю часть канала. Визуально подтвердите контакт между привоем и подвоем, чтобы получить удачный привой.
После того, как все прививки сделаны, оберните пластины парапленкой и дышащей лентой и установите пластины так же, как показано ранее, не нарушая рассаду или силиконовые полоски. Осторожно переместите пластины в камеру роста, установленную при температуре 26 градусов по Цельсию с 16-часовым светлым и восьмичасовым темным циклом. Через семь-10 дней оцените привитые саженцы в стерильных условиях, используя щипцы, чтобы аккуратно отклеить силиконовую полоску с одной стороны и освободить саженцы от каналов.
Удалите все придаточные корни, растущие из привоя, разрезав их свежим лезвием скальпеля или раздавив щипцами с тонкими наконечниками. Еще раз визуально оцените, прочно ли прикрепился подвой к привою, образуя удачный привой. Переместите успешные прививки в почву для размножения рассады и накройте почву прозрачным пластиком на несколько дней, пока рассада не укоренится.
Позвольте растениям расти при ранее упомянутых светлых и темных циклах при 21 градусе по Цельсию. Испытания прививки для определения оптимального протокола прививки показали, что общий показатель успешности прививки составляет 25%, когда семена прорастали непосредственно на силиконовых полосках с закрытыми каналами. Переориентация семян на сохранение семядолей зародышей и радикальное направление вниз во время прорастания немного увеличили эффективность прививки до 33%После удаления силиконового закрытия каналов, обеспечивающего контакт между семенем и питательной средой, 85% проростков успешно проросли.
Тем не менее, показатель успешности прививки остался на уровне 31%, что указывает на то, что оптимальный рост рассады не может быть достигнут при прорастании на полосе. Интересно, что продемонстрированный протокол, в котором саженцы культивировались вертикально на прививочной пластине перед введением в открытые каналы в полосах, дал общий показатель успешности прививки до 48% во время первых двух испытаний. Учитывая более низкий уровень успеха третьего и относительно небольшое испытание, которое можно объяснить небольшими вариациями в местах прививки, общий успех прививки составил 45%, что сопоставимо с методом, когда саженцы выращивали на горизонтальных пластинах, срезали на твердой поверхности и вставляли в полосы для прививки.
Однако демонстрируемый протокол занимает сравнительно меньше времени. Используя этот протокол, лаборатории, плохо знакомые с прививкой рассады, могут быстро создавать большое количество опорных устройств для прививки, имея возможность легко настроить устройство в соответствии со своими конкретными потребностями.
