Этот протокол предоставляет новый метод для старой техники, и он обеспечит новый подход для большого числа исследователей фундаментальных наук. Основными преимуществами этого метода являются его экономически эффективный характер, а также его адаптивность для использования более широкой научной аудиторией. Чтобы подготовить миграционную пластину, используйте светлый перманентный маркер, чтобы нарисовать линию по центру задней части каждой пластины из 48 хорошо и нарисовать три хэш-метки, чтобы разделить каждый хорошо на три отдельные области, представляющие интерес.
Затем пластины 1,5 до двух раз от 10 до четвертого одного прохода сердечного фибробластов в каждый колодец и культуры клеток в нормальных условиях культуры в течение 24 до 48 часов, пока они не достигнут от 90 до 95%слияния. Когда клетки будут готовы, удалить supernatant из каждого хорошо и использовать стерильные P200 пипетки отзыв, чтобы сделать один проход нуля вдоль нарисованных линий. Промыть скважины с низкой среде сыворотки, чтобы удалить любые непривязанные сердечные фибробласты и добавить 500 микролитров низкой среде сыворотки к каждой скважине.
Если используются фармакологические агенты, добавьте агенты к соответствующим скважинам. Далее, используйте перевернутый микроскоп с целью 20x захватить два нулевого часа изображения на хорошо с помощью маркировки, чтобы распоидать каждый хорошо, чтобы изображение верхней половины поцарапан линии. Затем переместив пластину, чтобы распоить нижнюю половину поцарапаемой линии в поле зрения, чтобы собрать второе изображение и поместить пластину в инкубатор культуры клеток в течение 24 часов.
В конце инкубации, мыть каждый хорошо с нестерильными ПВЗ и добавить 500 микролитров 4%paraformaldehyde к каждому хорошо в дым капот. После 10 минут при комнатной температуре, мыть каждый хорошо три раза в свежем PBS в течение пяти минут за стирку. После последней стирки пронизывают клетки 300 микролитров проницаемого раствора на колодец и нежного качания в течение 30 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации замените пермякирующий раствор 1%Kumasi блестящим синим пятном в течение 10 минут инкубации с нежным раскачиванием при комнатной температуре. Затем три, пять минут моет в PBS с качания. После последней стирки добавьте 300 микролитров PBS к каждому хорошо и осторожно распоимите пластину в том же положении, что и для изображения нулевого часа, прежде чем захватить два 24-часовых изображения за хорошо продемонстрировано.
В конце эксперимента откройте изображения и соответствующую программу анализа изображений и создайте новый слой на нулевом часовом изображении. Двойной щелчок, чтобы изменить название нового слоя линии слоя и выбрать инструмент кисти. Измените размер пикселя до 10 и цвет на красный и нарисуйте две отдельные линии, чтобы наметить царапину.
Линии не должны касаться каких-либо ячеек. Откройте 24-часовое изображение в программном обеспечении для визуализации и выберите инструмент перемещения. Удерживая кнопку управления, нажмите как линии, так и фоновые слои, нажмите в центре изображения нулевого часа и перетащите оба слоя к середине 24-часового изображения.
В 24-часовом изображении щелкните нулевой фоновый слой часа и измените непрозрачность до 50%, удерживая кнопку управления, нажмите как нулевой фон, так и слои линии и нажмите редактировать и свободно преобразовывать, чтобы свободно трансформировать слои, используя свободную трансформацию, выровнять фон нулевого часа и линейные изображения к 24-часовому фоновому изображению, чтобы линии миграции области были правильно расположены в 24-часовом изображении. Когда слой строки был успешно наложен, нажмите правой кнопкой мыши, чтобы удалить нулевой фоновый слой часа. Оставшийся слой линии может быть использован для определения количества ячеек, которые мигрировали в область нуля в течение 24 часов.
Затем сохраните новое изображение миграции как Photoshop, так и файл TIFF или JPEG. Для количественной оценки количества мигрирующих ячеек откройте изображение миграции и программу, которая принимает файлы TIFF или JPEG, и вручную подсчитайте количество ячеек, расположенных между ними, и коснувшись двух красных линий для обоих изображений для каждой хорошо. Затем замитмить количество мигрирующих ячеек на изображение.
Чтобы определить область миграции, откройте 24-часовое изображение, которое содержит линии миграции в программном обеспечении для визуализации, и сохраните изображение в качестве изображения области миграции. После сохранения нажмите фоновый слой и нажмите правой кнопкой мыши, чтобы удалить слой. Используйте инструмент кисти, чтобы заполнить область между линиями царапин, с тем же цветом, который был использован для линий и нажмите изображение, режим, и серая шкала, чтобы изменить изображение на черно-белый.
Сохраните изображение и откройте изображение области миграции и соответствующую программу анализа изображений. Нажмите редактировать, и инвертировать. Чтобы определить область линии миграции, нажмите на изображение, отрегулируйте и порог.
Область черной миграции покраснеет, а процентная область будет указана в пороговом поле. Затем замитмить процентную область для линии миграции и подтвердить, что это значение в паре с числом мигрирующих ячеек для одного и того же изображения. В этом анализе, 46 фибробластов из не-диабетических сердец и 129 фибробластов из диабетических сердец мигрировали в течение 24-часового экспериментального периода времени.
Измерение миграционной зоны, как было продемонстрировано, показало, что недиабетические нуля области составили 24,78% от общей площади измеряется, в то время как диабетическая миграция нуля области составила 16,77% от общей площади измеряется. Нормализация в области миграции обеспечивает лучшую и более строгую оценку миграции клеток и сводит на нет потенциальную человеческую ошибку. Например, если сравнить только количество мигрирующих фибробластов, то в этом анализе представляется, что количество клеток, мигрировавших в эту колодец, в два раза больше, чем у мигрирующих ячеек во второй колодец.
Однако, когда область царапины использовалась для нормализации данных, соотношение фибробластов к миграционному району было почти одинаковым в обеих скважинах. Не забудьте вернуть область миграции на 24-часовом изображении, как вы захватили в нулевом изображении часа. После этой процедуры, иммуногистохимия может быть проведена для изучения экспрессии белка в клетках.
Мы считаем, что этот новый подход к анализу миграции царапин позволит открыть больше возможностей для научных исследований, которые ранее были недоступны.
