Синапсы являются основными вычислительными единицами мозга. Представленный метод является простым и ценным инструментом для изучения синапсов и их молекулярных процессов, а также для понимания того, как они могут быть изменены при различных расстройствах головного мозга. Этот метод включает в себя фракционирование синаптосомных структур, изолированных от мозга.
Это позволяет исследователю захватывать эффекты, которые могут быть разделены в синапсе. Уровни распределения и активность конкретных белков также могут быть проанализированы с субсинаптическим разрешением. Эта процедура занимает около 11 часов для отдельного исследователя, чтобы завершить, если все идет гладко.
Человек, который никогда не выполнял эту технику, может испытывать трудности с продолжительностью этой процедуры, так как это, естественно, займет немного больше времени для тех, кто не знаком с шагами. Из-за продолжительности этого экспериментального дня мы настоятельно рекомендуем выполнить вскрытие с партнером, который может помочь вам облегчить быстрый сбор тканей, чтобы гарантировать, что образцы не будут установлены на льду дольше, чем это необходимо. Мы также рекомендуем подготовить буферы и материалы для столешницы за день до запуска этого эксперимента, чтобы все было в пределах легкой досягаемости, когда это необходимо.
Особенно это касается коллекционных трубок. К концу этой процедуры будут собраны множественные аликвоты в общей сложности 11 субклеточных фракций. Таким образом, наличие этих трубок, четко обозначенных заранее, сделает ваш день намного проще.
Для начала вставьте тонкие ножницы под кожу при обезглавливании разреза на перикраниальную глубину и сделайте средний сагиттальный разрез до интраназального шва, чтобы втянуть кожу головы из черепа. Работая от затылочной области к каждому височному аспекту, обрежьте фасцию и мышцу, чтобы обнажить внешнюю поверхность черепа за пределами каждого внешнего акустического мяса. Закрепите кожу головы и ростральный аспект черепа недоминирующей рукой, а другой рукой вставьте тонкие ножницы на два миллиметра в каудальную сторону большого отверстия, где спинной мозг виден на выходе.
Сделайте разрез средней линии до тех пор, пока ножницы не достигнут внутренней поверхности внутритеменной кости. Измените угол наклона ножниц так, чтобы лезвия шли параллельно спинной поверхности черепа. Продолжайте продвижение среднего сагиттального разреза рострально через теменную и лобную кости, используя сагиттальные и межфронтальные швы в качестве ориентира, и прекратите разрез сразу за межназальным швом.
Затем сделайте трехмиллиметровый перпендикулярный разрез к носовой кости, ростральный к межназальному шву, поместив ножницы перпендикулярно черепу с каждым лезвием, расположенным на носовом предчелюстном шве и сделав один ровный разрез. Закрепляя ростральный аспект, используйте одну сторону пары текстурированных щипцов, чтобы осторожно поднять череп из мозга, а затем поднять его латерально и вентрально. Повторяйте вдоль средней линии по мере необходимости, затем для другого полушария, пока вся поверхность мозга не будет обнажена.
С помощью изогнутых щипцов или тонкого шпателя осторожно приподнимите ростральную сторону мозга. Перережьте зрительный и черепно-мозговой нервы, чтобы завершить иссечение из черепа. Гомогенизируйте мозг с помощью гомогенизатора стеклянных пухов, помещенного на ледяную ванну в 12 проходов вверх вниз при 500 оборотах в минуту.
Делайте небольшую паузу при каждом нисходящем ударе, чтобы обеспечить тщательную гомогенизацию ткани. Переложите общий гомогенат мозга на 14-миллилитровую высокоскоростную трубку центрифуги с круглым дном и вращайте его при 800 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить супернатант, называемый S1.Перенесите S1 в новую центрифужную трубку, выбросьте гранулу. Возьмем две пять микролитровых аликвот S1 для анализа бицинхониновой кислоты и две 100-микролитровые аликвоты S1 для вестерн-блота.
Вращайте S1 при 9 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия для получения синаптического сомального супернатанта, или S2, и сырой гранулы синаптосомы или P2. Возьмем две 10 микролитровых аликвот S2 для анализа бицинхониновой кислоты и две 500 микролитровые аликвоты S2 для вестерн-блота. Выбросьте супернатант после получения аликвот. после центрифугирования при 9 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, получают супернатант S2' и промытую синаптосому, P2'Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте P2'in три миллилитра буфера A.Избегайте повторного использования темно-красной части на дне гранулы, которая в основном содержит митохондрии.
Возьмем две 20 микролитровые аликвоты P2'для анализа бицинхониновой кислоты и две 100 микролитровые аликвоты P2'для западного пятна. Для гипотонического лизиса промытой синаптосомы добавляют девять объемов охлажденного буфера B для повторного суспендирования P2' и гомогенизируют синаптосому в гомогенизаторе со стеклянным пухом. Перенесите образцы в 50-миллилитровые колпачковые конические центрифужные трубки и вращайте их на трубчатом револьвере в холодной камере с четырьмя градусами Цельсия в течение 15 минут.
Центрифугируют лизированный P2'at 25 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия для получения лизисного супернатанта или LS1 и лизисной гранулы, содержащей синаптосомные мембраны, или LP1. Возьмите две 50 микролитровых аликвот LS1 для анализа бицинхониновой кислоты и две 400 микролитровые аликвоты LS1 для вестерн-блота. Поместите LS1 в укупорочную центрифужную трубку для ультрацентрифугирования.
Центрифуга LS1 с фиксированным углом ультрацентрифуги ротора при 100 000 G в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия для получения синаптического цитозольного супернатанта, или LS2, и синаптической пузырьковой гранулы, или LP2. Повторное суспендирование LP2 в 500 микролитрах буфера A и с помощью иглы 23 калибра и одного миллилитра шприца отвесного LP два с мягким тритурацией. Возьмем две 10 микролитров аликвоты LP2 для анализа бицинхониновой кислоты и две, 250 микролитровых аликвот LP2 для вестерн-блота.
Перенесите около 30 миллилитров LS2 в центробежные фильтрующие установки с отсечкой 10 miliDalton и сконцентрируйте LS2 примерно до 0,5 миллилитров, вращаясь при 5 000 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Возьмем две, 10 микролитровых аликвот концентрированного LS2 для бицинхонинового анализа и две, 250 микролитровых аликвот концентрированного LS2 для западного пятна. Повторно суспендировать LP1 в одном миллилитре буфера B, и взять две, 10 микролитровых аликвоты LP1 для анализа бицинхониновой кислоты и две 50 микролитровые аликвоты LP1 для вестерн-блот.
Отрегулируйте оставшийся LP1 до конечного объема 7,5 миллилитров и конечную концентрацию сахарозы 1,1 моляра с буфером B и буфером C. Затем перенесите 7,5 миллилитров повторно суспендированного LP1 в 14-миллилитровую ультрацентрифужную трубку. Аккуратно наложите LP1 на 3,75 миллилитра буфера D и пометьте верхнюю часть раствора ручкой. Затем наложить около 1,25 миллилитра буфера А. И аналогично отметить верхнюю часть раствора ручкой.
Балансируйте пробирки для ультрацентрифугирования по весу, а не по объему, с добавлением буфера А с точностью до 10 миллиграммов. Центрифуга при 48 000 G в течение 2,5 часов при четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ультрацентрифуги и получение изображений неповрежденных градиентов для документирования различий каждого интерфейса сахарозы и успеха фракционирования. Осторожно удалите поверхностный слой 320-миллимолярной сахарозы и восстановите фракцию миелина на границе раздела 320 миллимоляров, 855 миллимоляров сахарозы в объеме 800 микролитров.
Пипетка поднимается со стенки труб по кругу, чтобы обеспечить сбор полной фракции. Затем извлеките фракцию SPM на границе раздела 855 миллимоляров, 1,1 миллимолярной сахарозы в объеме 1000 микролитров. Осторожно аспирируйте оставшуюся сахарозу и восстановите митохондриальную гранулу путем повторного использования в 200 микролитрах буфера B. Разбавьте фракцию SPM двумя объемами буфера B, а затем центрифугу в роторе с фиксированным углом в 3,5-миллилитровой центрифужной трубке.
Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу SPM в буфере A для окончательного объема 250 микролитров. Возьмите две, пять микролитровых аликвот SPM для анализа бицинхониновой кислоты и разделите оставшийся SPM пополам для западного пятна. На этом рисунке показаны изображения синаптосом электронной микроскопии.
Здесь показана синаптосома, содержащая синаптические везикулы как до, так и после синаптических компонентов и синаптические везикулы в митохондриях. Проведен иммуноблотический анализ субклеточных фракций для оценки маркеров чистоты фракций. По сравнению с исходным гомогенатом всего мозга анализ выявил обогащение n-кадгерина в фракции синаптической плазматической мембраны, альфа-синуклеина в синаптическом цитозоле, синаптофизина в фракции синаптического везикул и основного белка миелина в фракции миелина.
После того, как чистота фракции была установлена, количественный иммуноблоттинг может быть использован для определения локализации интересующих белков или запроса различий в распределении белка между генотипами или методами лечения. При попытке этой процедуры обязательно используйте стеклянную посуду без моющих средств, чтобы можно было собрать неповрежденную синаптосому. Кроме того, будьте осторожны при подготовке градиентов сахарозы, чтобы убедиться, что вы получаете четкие интерфейсы.
Это позволит успешно выделить фракцию синаптической плазматической мембраны. Различные структурные и функциональные анализы могут быть выполнены для повышения качества синаптических фракций, таких как электронная микроскопия, иммуноблоттинг, протеомика и другие молекулярные методы. Высвобождение нейротрансмиттеров или ферментативные анализы также могут быть выполнены для содействия метаболической жизнеспособности синаптосом.
Выделение синаптосомных структур было методом смены парадигмы для анализа функции и состава синапсов. Как мы видим раннюю синаптическую дисфункцию при нейродегенерации, тщательное рассечение молекулярных изменений на уровне синапсов поможет нам исследовать молекулярные механизмы этих расстройств.
