Этот протокол использует стратегию статической суспензии для дифференцировки предшественников поджелудочной железы в островковые кластеры, снижает стрессы, которые клетки испытывают во время встряхивания культуры, и значительно повышает успешность дифференцировки. Аппаратный протокол удобен для новичков и экономит время на оптимизацию первых четырех этапов. Персонал, владеющий базовыми методами культивирования стволовых клеток, может воспроизвести этот протокол с хорошими шансами на создание функциональных островковых кластеров.
Для начала предварительно покройте лунки для культивирования матригелем, соответствующим требованиям hESC, разведенным в ледяном DMEM/F12, и поместите планшет в инкубатор с увлажненным углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия и температурой 5% на 30 минут. Отработанную среду отсасывают из культуры ПСК и один раз промывают ДПБС. Диссоциируют культуру ПСК на отдельные клетки с помощью фермента клеточной диссоциации при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут.
После диссоциации промыть клетки, добавив теплую среду DMEM/F12, и переложить их в коническую пробирку объемом 15 или 50 миллилитров. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут и ресуспендируют гранулу в полной среде стволовых клеток, содержащей 10-микромолярный Y-27632. Затем выполните подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра.
После подсчета аспирата разбавляют матригель и немедленно высевают живые клетки при плотности от 1,6 до 1,8 раз от 10 до 5 на квадратный сантиметр на лунки, покрытые матригелем. Инкубируют клетки в увлажненном инкубаторе в течение 24 часов. Далее, на первом этапе, в первый день, подготовьте среду стадии 1А.
Замените отработанную среду средой стадии 1А и инкубируйте в течение 24 часов. На следующий день замените отработанную среду из лунок на свежеприготовленную среду стадии 1В. На втором этапе, в первый день, подготовьте среду стадии 2А и замените среду из скважин средой стадии 2А.
Инкубируйте в течение 24 часов перед добавлением среды стадии 2B в лунки; На третьем этапе, в первый день, отсасывают отработанную среду из лунок, затем добавляют свежеприготовленную среду стадии 3 и инкубируют в увлажненном инкубаторе. На четвертом этапе, в первый день, замените отработанную среду свежеприготовленной средой стадии 4 и инкубируйте в увлажненном инкубаторе. На четвертом этапе, на пятый день, предварительно обработайте микролунки 500 микролитрами раствора для промывки против прилипания на лунку.
Центрифугируйте планшет с микролунками при давлении 1 300 G в течение пяти минут и наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха не попали в микролунки. Далее отсасывают промывочный раствор из лунок и промывают один раз одним миллилитром ДПБС. Затем добавьте по одному миллилитру агрегационной среды в каждую лунку.
После удаления отработанной среды из культур-предшественников поджелудочной железы культуру однократно промывают DPBS перед диссоциацией на отдельные клетки реагентом для диссоциации при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10–12 минут. Промойте клетки теплым DMEM/F12 и переложите их в пробирку для центрифугирования при 300 G на пять минут. Ресуспендируйте гранулу в среде агрегации и выполните подсчет живых клеток.
Засейте от 2,4 до 3,6 миллиона клеток на лунку и добавьте агрегационную среду в каждую лунку, чтобы получить окончательный объем в два миллилитра на лунку. С помощью наконечника для дозатора P-1000 аккуратно протрите ячейки вверх и вниз для равномерного распределения. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут, чтобы захватить клетки в микролунках, и инкубируют в увлажненном инкубаторе в течение 24 часов, чтобы начать агрегацию.
После агрегации осторожно пипетируйте агрегаты вверх и вниз несколько раз, чтобы всплыть все неагрегированные ячейки. После того, как агрегаты осядут, осторожно удалите отработанную среду, содержащую плавающие неагрегированные ячейки без аспирационных агрегатов. Распределите свежую среду стадии 5 на поверхность планшета микролунок, чтобы вытеснить агрегаты из микролунок и переместить их в шестилуночную пластину со сверхнизким креплением.
После сбора всех заполнителей в шести лунках со сверхнизким креплением повторно суспендируйте их в среде стадии 5, чтобы отрегулировать плотность до 20 кластеров на 100 микролитров. Затем с помощью многоканальной пипетки дозируют 50 микролитров среды 5-й стадии в каждую лунку 96-луночного планшета ULA с плоским дном со сверхнизкой насадкой. Заполните угловые и краевые лунки 200 микролитрами DPBS.
Аккуратно перемешивайте ресуспендию доильного аппарата каждый раз перед дозированием. Затем добавьте 100 микролитров кластерной ресуспензии в каждую лунку плоскодонной 96-луночной пластины ULA. Поместите планшеты культуры на ровную поверхность в увлажненный инкубатор на 24 часа.
На следующий день или на пятом, втором дне с помощью многоканальной пипетки аккуратно удаляют 90 микролитров отработанной среды из каждой лунки и обновляют 100 микролитрами среды 5-й стадии. На шестом этапе, в первый день, замените 90 микролитров отработанной среды на 100 микролитров среды 6-й стадии на лунку. На седьмом этапе, в первый день, удалите отработанную среду и добавьте 100 микролитров среды стадии 7 на лунку.
В этом исследовании с использованием микролуночных планшетов одновременно были сгенерированы тысячи кластеров-предшественников поджелудочной железы с одинаковым размером и морфологией, а средняя эффективность агрегации составила около 74%.Важно отметить, что экспрессия PDX1 и NKX6.1 поддерживалась на высоких уровнях в этих кластерах после агрегации. Клетки, экспрессирующие инсулин, постепенно индуцировались в эндокринных кластерах, на что указывает увеличение сигналов инсулина GFP в живых культурах с течением времени. Размер кластера увеличивается со среднего диаметра 150 микрон до 220 микрон между пятой и седьмой стадиями.
Характеристика клеточного состава показывает, что островки чПСК седьмой стадии, генерируемые гибридным протоколом, были в основном эндокринными и состояли из четырех основных типов островковых клеток. Этот гибридный протокол генерировал в основном моногормональные островковые клетки и меньшинство бигормональных клеток. Дифференцирующиеся бета-клетки экспрессируют NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 и GLUT1.
Кроме того, 60% инсулина и PDX1 дважды позитивные клетки и 50% C-пептид и NKX6.1 были индуцированы в культурах седьмой стадии. Статические анализы секреции инсулина, стимулированные глюкозой, in vitro показали, что островки hPSC седьмой стадии секретируют высокие уровни инсулина в ответ на высокий уровень глюкозы и прямую деполяризацию. Общее содержание инсулина в островках hPSC составляет примерно половину от количества трупных островков.
Система статических культур на основе нескольких лунок для получения островков, полученных из стволовых клеток, облегчает проведение различных анализов in situ и может служить подходящей платформой для разработки протоколов и маломасштабных скрининговых исследований. Чтобы свести к минимуму кластерное слияние при статической культуре в 96-луночном планшете, не наклоняйте планшет при смене среды. Всегда держите пластину горизонтально на ровной поверхности.
