Этот метод может эффективно идентифицировать генотип S и точно идентифицировать самонесовместимость цитрусовых, предоставляя необходимую информацию для выбора подходящих деревьев-опылителей. Это эффективный по времени, простой и надежный метод выбора подходящих родительских деревьев в селекционных программах. Эта техника проста и легка в исполнении, а проведение эксперимента в первый раз требует терпения и внимательности.
Идентификация S-генотипа и S-специфический праймер требуют большего внимания и заботы. Продемонстрировать процедуру будет Ю Ху, магистрант из моей лаборатории. Начните сбор пыльцы, отнеся в лабораторию Majia pomelo, Citrus maxima, цветы.
Соберите пыльники с помощью пинцета и поместите их в чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу. Высушите пыльцевые зерна, поместив чашку Петри, содержащую пыльники, в духовку при температуре 28 градусов Цельсия на 24 часа. После высыхания сохраните пыльцу в герметичном пакете с застежкой-молнией Micro Centron, содержащем изменяющий цвет силикагель.
Закройте пакет и наклейте на пакет этикетку с названием сорта пыльцы и датой хранения. Налейте 300 микролитров жидкой среды в колпак двухмиллилитровой центрифужной трубки и равномерно посыпьте пыльцу с помощью щетки для опыления. Поместите пыльцу в увлажненный черный ящик и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение 12 часов.
После инкубации отрежьте верхний одномиллиметровый наконечник от наконечника пипетки объемом 1 000 микролитров и аспирируйте пыльцу небольшим количеством культурального раствора. Поместите пыльцу в центр предметного стекла микроскопа и накройте его покровным стеклом. После этого понаблюдайте за образцом с помощью инвертированного микроскопа, используя 10-кратный объектив.
Выполните три независимые репликации, используя примерно одинаковую плотность пыльцы для каждой реплики. Для опыления используйте щетку для опыления, чтобы распределить достаточное количество жизнеспособной пыльцы на поверхность рыльца, не повредив пестик. Накройте опыленные цветы сульфатным бумажным пакетом и предотвратите опыление генотипически отличной пыльцой, запечатав пакет с помощью скрепки.
Напишите на этикетке название вида, а также количество и время опыления. Повесьте этикетку на ветки возле опыляемых цветков. Снимите пакеты для опыления примерно через три-четыре дня после опыления и соберите опыленные цветы в пакеты с застежкой-молнией.
Немедленно удалите лепестки, цветоложи и завязи с цветков и погрузите сросшееся рыльце в пробирку центрифуги, содержащую свежеприготовленный фиксирующий раствор. Инкубируйте рыльце и укладку в фиксирующем растворе в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день откажитесь от фиксирующего раствора перед смыванием рыльца и уложите два-три раза в 95%-ный этанол.
Затем добавьте 70% раствор этанола в стиль, убедившись, что образец полностью погружен в раствор. Стили на этом этапе могут храниться при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух месяцев. Для окрашивания анилино-синим три-четыре раза промойте образцы стиля, хранящиеся в 70% этаноле, дистиллированной водой.
Погрузите его в четырехмолярный раствор гидроксида натрия и запечатайте перед инкубацией на водяной бане с температурой 65 градусов Цельсия в течение 60 минут. На этом этапе цвет стиля меняется с желто-белого на оранжево-красный. Далее замочите стили в дистиллированной воде.
Через 30 минут слейте дистиллированную воду и промойте стили дистиллированной водой три-четыре раза или до тех пор, пока цвет стиля не станет желтым. Затем добавьте анилиновый синий до тех пор, пока образец не будет погружен в воду, и инкубируйте в течение 12 часов в темноте. Наблюдайте за ростом пыльцевой трубки под флуоресцентным микроскопом.
Поставьте слайд на ровный стол. Разделите фасон на две половинки вдоль продольной оси с помощью скальпеля. Поместите одну половину стиля на предметное стекло и добавьте две-три капли полиэтиленгликоля на поверхность предметного стекла.
Затем накройте его покровным листом. После этого поместите предметное стекло на столик микроскопа над апертурой и визуализируйте с помощью 10-кратного объектива. Используйте фильтр DAPI и наблюдайте за ростом пыльцевой трубки.
Соблюдайте пять стилей для каждого типа опыления. Жизнеспособность пыльцы Citrus maxima и скорость прорастания были количественно определены с помощью флуоресцентной микроскопии. Совместимая пыльца успешно проросла на поверхности рыльца и произвела нормальную пыльцевую трубку, которая росла и в конечном итоге приводила к оплодотворению в яичнике.
Напротив, несовместимые пыльцевые трубки проросли примерно на 2/3 стиля, а затем перестали расти. Электрофорез в агарозном геле обнаружил продукт ДНК, амплифицированный с использованием S-локус-специфических праймеров. Он показал амплификацию продукта ДНК от 500 до 1000 пар оснований.
Был идентифицирован соответствующий S-генотип. С помощью этого метода был идентифицирован 21 гаплотип S у разных видов цитрусовых. Этап опыления имеет решающее значение.
Только успешное опыление может обеспечить последующее наблюдение за пыльцевыми трубками. Методика была использована для анализа черт самонесовместимости, а также для изучения и выявления женских детерминант самонесовместимости. Этот метод важен для исследований самонесовместимости и программ разведения.
Это также может помочь фермерскому сообществу в выборе деревьев-опылителей для своих садов.
