Этот протокол представляет собой простой метод количественной оценки эффективности, с которой различные штаммы и виды дрожжей спариваются друг с другом. Предлагаемый метод прост, надежен и эффективен. Метод может быть распространен на любой штамм дрожжей.
Метод, описанный в этом исследовании, может быть использован для понимания того, как происходит видообразование у дрожжей. Более того, штаммы, которые мы описываем, могут быть особенно полезны для разработки экспериментов с потоком генов. Сила метода в том, что он действительно прост.
Некоторые небольшие корректировки, такие как время инкубации, могут потребоваться в зависимости от конкретного используемого штамма. Начните возрождать гаплоиды А и Альфа из замороженных запасов, нанеся дрожжевой инокулят на дрожжевой экстракт, пептон, декстрозу или агаровую пластину YPD. Дайте им расти в течение 48 часов при 30 градусах Цельсия, чтобы получить отдельные колонии.
После инкубации инокулируют отдельные колонии из пластины YPD и пяти миллилитров среды YPD и инкубируют при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов при встряхивании 250 об / мин. После этого инкубационного периода клетки находятся в стационарной фазе роста. На свежей пластине YPD нарисуйте сетку эффективности сопряжения в виде прямоугольника размером 1 на 1,5 сантиметра, разделенного на три коробки, каждая размером 1 на 0,5 сантиметра.
Инокулируйте пять микролитров культуры YPD двух типов спаривания на крайний левый и крайний правый прямоугольники. Этот объем соответствует примерно 5 умножить на 10 пятых гаплоидных клеток в каждой секции. Инкубируйте тарелки в течение 24 часов при температуре 30 градусов Цельсия.
Чтобы смешать равное количество дрожжевых клеток, удалите около 1/3 роста дрожжей, развившегося во внешних коробках, с помощью стерильной зубочистки и ресуспендируйте удаленные клетки в 20 микролитрах воды в стерильном флаконе объемом 1,5 миллилитра. Следуйте этому для каждого гаплоида. Затем разбавьте пять микролитров этой суспензии в двух миллилитрах воды и измерьте оптическую плотность с помощью спектрофотометра на 600 нанометрах.
Исходя из значения оптической плотности и количества клеток на миллилитр при одной оптической плотности, добавьте необходимые объемы обоих гаплоидов в свежий и стерильный флакон объемом 1,5 миллилитра. Хорошо перемешайте его с помощью пипетки. Конечный объем этой суспензии обычно составляет от шести до восьми микролитров.
Далее прививаем эту суспензию в центральную сетку. Инкубируйте тарелку при температуре 30 градусов по Цельсию в течение семи часов, позволяя гаплоидам спариваться. После семи часов инкубации соскребите клетки с центрального прямоугольника с помощью зубочистки или наконечника пипетки и разведите в двух миллилитрах стерильной воды.
Проводят дальнейшие разведения, а затем распределяют клеточную суспензию на агар YPD для получения единичных колоний. После покрытия инкубируйте пластины YPD при температуре 30 градусов Цельсия в течение 36-48 часов, чтобы развились отдельные колонии. Убедитесь, что из каждого эксперимента по спариванию получено несколько сотен отдельных колоний для скрининга, чтобы обеспечить статистическую значимость данных.
Чтобы идентифицировать диплоидные колонии на пластине, перенесите одиночные колонии, нанеся их по отдельности на пластину с двойным выпадением, в которой отсутствуют аминокислоты, для которых штаммы являются ауксотрофными. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 48 часов и рассчитайте эффективность спаривания, ню. Надежность протокола позволила легко дифференцировать эффективность спаривания между двумя штаммами, SK1AM и ScAM.
В то время как штаммы SK1 спаривались с очень высокой эффективностью, штаммы ScAM спаривались с относительно более низкой эффективностью. Эффективность спаривания штаммов ScAM значительно снижалась, когда окружающая среда не содержала глюкозу в качестве первичного источника углерода, что указывает на то, что спаривание является энергетически затратным процессом, а рост на альтернативных источниках углерода качественно снижает эффективность спаривания. При разрешении спариваться в течение разных периодов времени спаривание не наблюдалось в течение первых четырех-пяти часов.
Первые диплоиды появились только через четыре-пять часов, что указывает на то, что это время, необходимое для завершения процесса спаривания в данной среде. После этого эффективность спаривания быстро возрастала. По прошествии семи часов на расчеты эффективности спаривания повлиял тот факт, что на пластине начался митотический рост.
Убедитесь, что одинаковое количество обоих гаплоидов смешано. Отклонения от этого приведут к изменениям в независимых повторах протокола. Вопрос о том, как поток генов влияет на адаптацию и видообразование, остается открытым.
Поскольку ауксотрофные маркеры вставляются рядом с локусом MAT в наших штаммах, это помогает ответить на этот важный вопрос.
