В этом протоколе описываются обычные образцы микропластика и пробы, анализируемые из почвы. Метод включает в себя семь частей. К ним относятся отбор проб и подготовка почвы, флотация по плотности, сбраживание примесей, окрашивание, вакуумная фильтрация, морфологическое наблюдение и идентификация полимеров.
Здесь мы представляем два различных аналитических процесса последних двух этапов, которые могут выполняться независимо друг от друга в зависимости от доступности инструмента. Соберите репрезентативную пробу почвы с помощью метода пятиточечного отбора проб в виде двойной формы по устойчивой области. Для сбора используйте 30-сантиметровый шнек из нержавеющей стали.
Соберите и установите образцы в непластиковую емкость, например, в алюминиевую фольгу. Высушите почву при комнатной температуре вдали от прямых солнечных лучей или используйте духовку, настроенную на 40 градусов Цельсия, и сушите почву в течение минимум 24 часов до полного высыхания. Если имеется сушилка для грунта, используйте ее для обработки нескольких образцов почвы одновременно с фильтром в отдельных камерах, чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения.
После высыхания при необходимости измельчите почву. Используйте чистые, не пластиковые инструменты. Измельчите и сохраните сухую почву.
Используйте металлическое сито от двух до пяти миллиметров. С помощью двух плотных маленьких весов разложите мелкий плюс или минус 0,05 гран образца почвы на пластиковую свободную бумагу для взвешивания или алюминиевую фольгу. Образцы можно хранить в плюс трех контейнерах, например, стеклянных флаконах.
Переложите мелко измельченный высушенный образец почвы в чистый стеклянный стакан объемом 600 миллилитров А. Добавьте в стакан 230 миллилитров насыщенного раствора хлорида натрия А. Обеспечьте точную маркировку всех контейнеров для хранения и стаканов. Поместите стакан А на магнитную пластину для перемешивания у стеклянной магнитной мешалки. Помешивайте раствор в течение 30 минут со скоростью 260 оборотов в минуту.
После полной гомогенизации извлеките магнитную мешалку из раствора и промойте насыщенным раствором хлорида натрия, чтобы предотвратить вынос пластиковых частиц из раствора. Поместите стакан на ровную поверхность без прямых солнечных лучей и оставьте его на ночь, пока не произойдет полное отделение плотности. Как только содержимое стакана А полностью отделится, осторожно перенесите надосадочную жидкость в новый стеклянный стакан В. Промойте внутренние стенки стакана А насыщенным раствором хлорида натрия.
Добавьте четыре моляра раствора гидроксида натрия к образцу в стакане В, чтобы получить фиксированный объем в 500 миллилитров. Помешивайте раствор в течение 30 минут со скоростью 260 оборотов в минуту. Затем снимите магнитную планку для перемешивания и поставьте стакан на плоскую поверхность вдали от прямых солнечных лучей и оставьте его на ночь.
Как только содержимое пекаря В полностью отделится. Перенесите надосадочную жидкость из стакана B в новый стакан C. Промойте внутреннюю стенку стакана B дистиллированной водой, чтобы обеспечить максимальный перенос частиц. Добавьте ранее приготовленный раствор нового красного размера в стакан С до достижения конечной концентрации 0,5 моляра.
Размешайте раствор стеклянным стержнем до полной гомогенизации. Затем дайте раствору поинкубироваться в течение 30 минут в доке, накрыв стакан алюминиевой фольгой. Для начала настройте систему вакуумной фильтрации следующим образом.
Стеклянная воронка, металлический зажим, основание вакуумной фильтрации, сборный стакан, соединительный шланг, конденсатоотводчик и вакуумный насос. Аккуратно удалите новые мембраны из емкости для хранения с помощью пинцета. Поместите фильтрующую мембрану по центру и ровно на верхнюю часть основания вакуумной фильтрации.
Обеспечьте надежное соединение, совместив основание вакуумной фильтрации со стеклянной воронкой, закрепив их металлическим хомутом. Активируйте вакуумную фильтрацию и медленно вылейте жидкость из стакана С в стеклянную воронку. Промойте стакан C несколько раз дистиллированной водой, чтобы максимально восстановить частицы.
Накройте стеклянную воронку алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму загрязнение. После фильтрации проб промойте боковую сторону стеклянной воронки дистиллированной водой, чтобы обеспечить минимальную потерю частиц. Оторвите вакуумный насос и осторожно извлеките фильтрующую мембрану из пластины с помощью пинцета.
И поместите каждую мембрану в индивидуальную стеклянную чашку Петри. Добавьте пленки, чтобы полностью высохнуть, перед тем как закрыть чашку Петри и завернуть ее в алюминиевую фольгу. Хранят его в сухом и темном месте до дальнейшего анализа.
Если для последующей идентификации полимера требуется точное расположение флуоресцентных частиц на мембранах, например, с помощью ИК-Фурье, обратитесь к приведенным ниже шагам. С помощью черной гелевой ручки аккуратно отметьте начальную позицию 10 отметок на фильтрующей мембране в форме буквы Т. Активируйте флуоресцентный прибор следующим образом: хозяин, источники флуоресценции, монитор и флуоресцентный микроскоп.
Включите прибор и установите светодиод источников на максимальную яркость. Используйте яркое поле, DF и флуоресцентный свет, кнопку переключения FL для получения изображений DF и FL соответственно. Программное обеспечение DP2-BSW для записи образцов наблюдений, но только определение с микроскопа для повышения четкости экрана.
Сделайте снимки яркого поля в положении BF и включите его в положение FL и флуоресцентный фильтр, чтобы сделать снимки в док-станции. Убедитесь, что последовательность наблюдения в поле зрения составляет от одного до 10. Убедитесь, что снимки BF и FL должны быть сделаны в одном и том же положении.
Для идентификации полимеров с помощью LDIR выполните следующие действия с помощью микроскопа. Настройте систему микроскопа следующим образом. Камера, фильтры, предметный столик для увеличения и микроскопа, а также компьютер.
Оберните держатели фильтрующей мембраны салфетками, не содержащими пыли. Затем закрепите мембраны в держателе и наденьте на предметный столик микроскопа. Убедитесь, что камера подключена, а увеличение микроскопа соответствует типу образца и одинаково для всех образцов из одного набора.
Чтобы количественно оценить частицы на записанных изображениях, следуйте пошаговым инструкциям, приведенным в рукописи. Если для идентификации полимерных частиц используется ИК-Фурье спектрометрия, выполните следующие действия. Включите ИК-Фурье спектрометр LUMOS и соответствующую программную почту, например, наблюдения и записи.
Заполните жидкостью азот для активации машины. Очистите щуп перед зеркальным отражением каждого образца. Идентификация частиц для мониторинга с помощью записи экрана в режиме реального времени.
Отрегулируйте положение и резкость, манипулируя коромыслом. Переместите операционную платформу в центр и захватите текущий спектр воздушного фона. Измерьте от трех до пяти неподвижных точек на целевом фрагменте, а затем расположите зонд в соответствии с расположением этих неподвижных точек.
На странице результата сохраните исходные данные. Рассмотрите спектр и сравните спектр с пластическим спектром в стандартной библиотеке, чтобы присвоить индекс теплового качества образца. Если для идентификации полимерных частиц используется LDIR, выполните следующие действия.
Поместите фильтрующую мембрану в новый стеклянный флакон объемом 20 миллилитров. Добавьте 20 миллилитров чистого этанола. Плотно закройте флакон и оберните крышку парапленкой, чтобы предотвратить протекание.
Ультразвуковую обработку образцов в ультразвуковой ванне не менее одного часа, пока все частицы не будут ресуспендированы. Мембрана может окрашиваться, но это не помешает идентификации полимера. Снимите и выбросьте мембрану.
Поместите стеклянный флакон с раствором этанола на магнитную мешалку и добавьте в флакон небольшую магнитную стеклянную мешалку. Дайте этанолу испариться до уровня менее пяти миллилитров, установив температуру на 100 градусов Цельсия и перемешивая на низкой скорости, чтобы частицы оставались взвешенными. Чтобы подготовить образец к анализу на LDIR, медленно встряхивайте образцы до тех пор, пока все частицы не будут равномерно взвешены в растворе и быстро подготовленных 10 микролитров образца на предметное стекло и дайте этанолу испариться.
Повторите этот шаг еще два раза, чтобы проанализировать по три репликации на образец на каждом слайде. Предметное стекло LDIR вставляется в прибор, а название образца вводится в подключенное программное обеспечение. После этого прибор инициирует автоматическое сканирование.
Полученный анализ дает подробные данные о химическом составе отдельных частиц, распределении различных полимеров в образце, а также размерах частиц. Последующая обработка данных подробно описана в разделе 8 протокола, например, с использованием изображения J, а также в разделе расчета результата в рукописи. Чтобы проверить диапазон восстановления этой методологии, образцы из трех различных твердых матрасов, диоксида силикона, SD, бентонитовой глины, BT и почвы, были проанализированы в наборах по три повтора.
Предположим, что все частицы микропластика представляют собой однородную сферу. Это означает, что в каждом пятиграммовом сухом твердом образце содержится более 48 740 наименований. На основе программного обеспечения image J можно просмотреть информацию о количестве частиц в одном образце, и по этим трем формулам можно рассчитать окончательный коэффициент восстановления микропластика.
Вот некоторые результаты этого эксперимента. Во-первых, это скорость восстановления микропластика из различных твердых матриц. Средние показатели восстановления составляют 84%83% и 90% BT, SD и почвы соответственно.
Исключено вмешательство результата от чистого образца к химической идентификации. В среднем, 86% твердых частиц ПЭ были успешно восстановлены. Дно является результатом полимерного типа этих образцов.
Показано, что кроме полиэтилена обнаруживаются также фенольная смола, поливинилхлорид, полиамид и полипропилен. Этому результату может способствовать незначительная доза образца во время переноса надосадочной жидкости, фильтрация или неправильная идентификация. Эти загрязнения могли быть вызваны фильтрующими устройствами, лабораторным оборудованием, атмосферными осадками или дистиллированной водой.
Есть несколько снимков, сделанных с использованием разных методов идентификации полимеров. Эти два снимка основаны на методе FTIR и сделаны в одной и той же области мембран при дневном и флуоресцентном свете. Частицы, которые кажутся прозрачными на рисунке А и мигающими зелеными на рисунке В, считаются пластиковым материалом.
Вот типичный случай, который показывает сравнение спектра между обнаруживаемой частицей и стандартной диаграммой спектра. Спектр ПЭ-частиц совпал с ближайшими библиотечными спектрами с некоторым качеством совпадения 98%Эта картина получена методами LDIR. Реальная картина и распределение показаны на рисунке А и некоторой подробной информации, такой как химический состав отдельных частиц.
Качество совпадения, а также размер частиц показаны на рисунке B. Загрязнение микропластиком наземной среды является научной темой, которой в последнее десятилетие уделяется все больше внимания. Тем не менее, количественная оценка была проведена только в последнее время, а метод обнаружения почвенного микропластика не стандартизирован. В этом протоколе описывалась методология отбора проб, разделения и химической идентификации частиц микропластика.
Для повышения простоты эксплуатации и широкого внедрения, этот метод является недорогим, а материалы легко доступны. Этот протокол демонстрирует потенциал в качестве руководящей основы, представляя комплексный подход, подходящий для различных типов почв, обеспечивая точную количественную оценку и анализ микропластика.
