Siderophores являются низкий молекулярный вес, металл-хелатирующих биомолекул, участвующих в железной езде на велосипеде в окружающей среде. Этот протокол позволяет быстро оценить пропускную способность siderophore в пробах почвы и растений. Предыдущие методы обнаружения siderophore ликвидировали критически важную среду микробного сообщества.
Наша методика позволяет обнаруживать в относительно нетронутом микробном сообществе и среде обитания, в которой он участвует. Поскольку наличие железа имеет решающее значение для продуктивности сельского хозяйства, поэтому в этом протоколе может быть использован для исследования роли микробов в модулирование доступности железа для растений. Кроме того, этот метод можно было бы использовать для оценки воздействия практики управления фермерскими хозяйствами на здоровье почв и общины, производящие побочные эффекты, а также на развитие таких общин с течением времени.
Для начала, кислота мыть всю стеклянную посуду в 100 миллимоляры соляной 100 миллимоляновой азотной кислоты в течение как минимум двух часов до использования в анализе CAS. Приготовьте алюминиевую форму для выпечки, наполненную песком лабораторного класса, и накройте ее алюминиевой фольгой. Автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 30 минут и отложите в сторону.
Приготовьте HDTMA, добавив 0365 граммов до 20 миллилитров двойной деионизированной воды, и поместите раствор в водяной бане при 37 градусах по Цельсию для содействия solubilization. Добавьте 0302 грамма CAS в 25 миллилитров двойной деионизированной воды, нежно помешивая стерильным магнитным батончиком. Затем добавьте пять миллилитров одного гексагидрата хлорида железа моляра в 25 миллилитров раствора CAS, продолжая при этом мягко перемешивать.
Теперь медленно добавьте 20 миллилитров раствора HDTMA в сложный раствор железа CAS, нежно помешивая. Подготовьте буферный раствор, растворив 15,12 грамма PIPES в 375 миллилитров двойной деионизированной воды с нежно помешивая. Отрегулируйте рН до 6,8 с помощью пяти гидроксида молярного натрия.
Затем добавьте воду, чтобы довести объем до 450 миллилитров. Теперь добавьте пять граммов агарозы в раствор. Автоклав буферного раствора PIPES и комплексного решения IRON CAS при 121 градусе по Цельсию в течение 30 минут.
Аккуратно добавьте все комплексное решение iron CAS в весь буфер PIPES в шкафу биобезопасности после того, как каждый из них был автоматически. Поместите смешанный раствор в водяную баню при 50 градусах по Цельсию. Теперь поместите стерильный реагент лодки в стерильный песок в шкаф биобезопасности и тепла до 50 градусов по Цельсию.
Перенесите железный комплекс CAS agar на лодку, затем быстро aliquot 100 микролитров к каждой колодец ясного плоского дна стерильной 96-ну микроплюс. Подготовка 800 микромоляных пиовердов стандарта в ранее подготовленной модифицированной среде M9. Разбавьте раствор в 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 микромолярных растворов.
Добавьте EDTA в 500 миллилитров ранее подготовленной модифицированной среды M9 для подготовки стандарта EDTA 3,2 миллимоляра. Разбавьте этот раствор в 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 микромолярных растворов. Чтобы создать стандартную кривую, добавьте 100 микролитров каждой концентрации пиовердина и ЭДТА в отдельные скважины 96-ну микроплета, содержащего 100 микролитров железа CAS сложной агарной среды.
Сделайте дубликаты технических репликаций каждой концентрации. Также добавьте пустые колодцы только с M9. Используя считыватель микроплатформ, измеряйте абсорбцию после инкубации через один, шесть и 24 часа при 22 градусах Цельсия и используйте измерения абсорбции для генерации стандартных кривых. Вымойте оборудование для отбора проб с 22 микрон фильтр двойной деионизированной воды следуют 70% этанола и протрите бумажными полотенцами.
Выполните стирку перед отбором проб и между образцами для поддержания стерильной техники и уменьшения перекрестного загрязнения. После excising тканей завода и выкапывать малый шарик корня от заводов в поле, поместите шарик корня в отдельно обозначенный полиэтиленовый пакет для разъединения образца в окружающей среде лаборатории. Поместите все образцы непосредственно на лед и держите при четырех градусах по Цельсию до тех пор, пока образцы не будут обработаны для анализа производства siderophore.
Отдельные корневые связанные образцы почвы навалом, слабо связаны корневой почвы и плотно связаны корневой почвы. Для этого вынюхите корневые шарики из мешков и аккуратно стряхнуть почву с корневого шарика. Потрясенный от почвы, вместе с почвой, оставленной в мешке, составляют основную почву.
Это слабо связанная ризосферная почва. Создайте плотно связанную почву rhizopshere, взяв корни с плотно связанным образцом и положив их в центрифугу трубки. Добавьте 30 миллилитров двойной деионизированной воды и вихря в течение двух-трех минут.
Удалите корни, чтобы получить плотно связаны ризосфере почвы суспензии разбавления. Гомогенизировать каждый образец почвы в образец мешок путем смешивания и поворота почвы как можно больше, не открывая мешок. После того, как каждый образец был тщательно смешан, aliquot и приостановить два грамма каждого образца почвы в 20 миллилитров модифицированных M9 среды в стерильной 50 миллилитров центрифуги трубки.
Разбавить образец, а затем запечатать трубку стерильной вилкой пены, чтобы аэрация. Для плотно связанных образцов ризосферы добавьте два миллилитров навоза корневой почвы в 20 миллилитров модифицированной среды M9 в стерильную 50-миллилитровую центрифугу. Разбавить образец, а затем запечатать трубку стерильной вилкой пены, чтобы аэрация.
Чтобы подготовить образец ткани, поверхность стерилизовать корень, стрелять, и зерно с 70%этанола. Macerate два грамма свежей ткани в 20 миллилитров модифицированной среды M9 с помощью блендера на высоком в течение 30 секунд. Затем перенесите образец в стерильную 50-миллилитровую центрифугу, разбавьте и загерметите трубку стерильной пенопластовой вилкой.
Чтобы обогатить производство siderophore через ограничение железа инкубировать 50 миллилитров центрифуг трубки при комнатной температуре и встряхнуть при 160 об/мин. В 24, 48 и 72 часа после начала культуры обогащения удалите один миллилитр подсемейки из обогатительных труб с использованием стерильной техники. Центрифуга подлагерей на 10000 раз G в течение одной минуты в двух миллилитровых центрифуг труб гранулировать клетки.
Используя стерильную технику, добавьте 100 микролитров супернатанта к 100 микролитровому раствору железа CAS комплексного агара в дублировании или тройном в микропластине. Также добавьте 100 микролитров стерильной среды M9 в качестве заготовок. Затем инкубировать пластину при 28 градусах по Цельсию.
Каждая пластина должна быть запечатана и покрыта фольгой перед размещением в инкубаторе. Приостановить оставшиеся супернатанты и гранулы для каждого образца в свой собственный стерильный две миллилитровые центрифуги трубки. Добавьте 400 микролитров стерильного глицерола в каждую образец супернатантной трубки и повторно приостановите гранулы для создания запасов глицерола.
Заморозить запас при температуре минус 80 градусов по Цельсию для более длительного анализа. Измерьте поглощение на 6, 24, 48 и 72 часах на длине волны 420 нанометров. Биосинтезированная псевдомонасом смесь пиовердина флуоресцента использовалась в качестве стандарта для интерпретации и количественной оценки абсорбции образцов в образцах эквивалентности пиовердина в микромоларе.
Здесь показана взаимосвязь между абсорбатью на 420 нанометров и стартовой концентрацией пиовердина. Siderophore активность 72-часового обогащения была оценена в 48 часов инкубации для определения влияния генотипа и типа образца на изоляцию siderophore. Активность сайдрофора в массовых образцах почвы была относительно низкой и не проявляла различий между генотипом пшеницы, из которого была отобрана основная почва.
Тем не менее, обогащение слабо связанной почвы, изолированной от генотипа 725, продемонстрировали большую выработку сайдрофора по сравнению со слабо связанной почвой из Мадсена и 727, но не от Левджайна. И наоборот, побочные эффекты производства в обогащении из плотно связанной почвы не сильно зависит от генотипа. Культуры обогащения зерновых тканей дали относительно низкое производство siderophore независимо от генотипа.
Обогащение ткани Lewjain стрелять было значительно ниже siderophore производства, чем другие генотипы, и 725 стрелять ткани культур привело к более переменной siderophore производства. Наибольшая разница в активности siderophore наблюдалась в культурах обогащения корневых тканей, где 725 имели более чем на 200% большую активность боковогофора, чем все другие генотипы. Одним из наиболее облагающих налогом аспектов выполнения протокола является поддержание асептических условий при выполнении многих шагов по созданию микропластицы CAS iron agar и тестированию образцов для активности siderophore.
Широкий спектр хроматографических методов, основанных на культуре или ДНК, может быть применен либо к фактическому микротитру, либо к культуре глицерола для дальнейших биохимических тестов или генетической характеристики и метаболического моделирования. С помощью этого протокола siderophore активность может быть позже связана с конкретными организмами, ответственными за эту деятельность или впоследствии направлены в качестве механизма для более крупных экологических воздействий. Этот протокол можно было бы легко модифицировать для оценки производства siderophore в культурах обогащения, полученных из образцов, взятых из других экологических отсеков, включая воздух, воду и отложения.
