Основной целью этой процедуры является реализация комплексного протокола для культивирования и характеризации микрофагов на различных поверхностях имплантатов, а также характеристики подтипов микрофагов. В рамках этой характеристики используется несколько методов, включая qRT-PCR, EISA и CLSM, для определения профилей экспрессии генов, секреторных белков и маркеров клеточной поверхности. Результаты показывают полезность и эффективность реализованного протокола в поляризационных микрофагах и поверхностях имплантатов, а также их точную идентификацию на основе экспрессии генов, секретируемых белков и маркеров клеточной поверхности.
Кроме того, маркеры описывают устойчивые и специфические паттерны экспрессии, которые могут быть использованы для различения различных подтипов МДМ. В целом, исследование будет способствовать разработке и дизайну иммуномодулирующих материалов для улучшения и содействия успешным процессам регенерации тканей, предотвращения хронического воспаления, связанного с имплантатами, и улучшения успешной интеграции имплантатов. Для начала суспендируйте изолированные мононуклеарные клетки периферической крови человека в 15 миллилитрах предварительно подогретой среды для присоединения моноцитов и перенесите их в колбу для культуры клеток Т-75.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 90 минут для адгезии. После инкубации выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки предварительно подогретой средой RPMI 1640, дополненной 10% FBS и 1% пенициллином и стрептомицином, осторожно наклонив колбу для удаления неадгезивных или слабо прилипших клеток. Добавьте к адгезивным клеткам 15 миллилитров готовой среды, содержащей 10 нанограмм на миллилитр колониестимулирующего фактора макрофагов.
И высиживайте в течение шести дней, чтобы способствовать дифференциации. После дифференцировки извлеките питательную среду из колбы и промойте клетки 10 миллилитрами PBS в течение пяти минут. Чтобы отделить клетки-адгезии, добавьте 10 миллилитров предварительно подогретого раствора для отделения клеток и инкубируйте в течение 30 минут.
Затем аккуратно постучите по колбе, чтобы освободить клетки, и перенесите их в 50-миллилитровую трубку. Чтобы отделить оставшиеся ячейки, добавьте в колбу 10 миллилитров PBS и удалите ячейки. Перенесите оторвавшиеся клетки в 50-миллилитровую трубку.
Центрифугируйте отделенную клеточную суспензию при 300 г в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость перед тем, как снова суспендировать клетки в пяти миллилитрах предварительно подогретой полной среды. Используя окрашивание трипановым синим, подсчитайте клетки на гемоцитометре, чтобы определить количество клеток и жизнеспособность. Приготовьте клеточную суспензию, доведя количество клеток до 160 000 клеток на один миллилитр готовой среды.
Затем очистите диски биоматериала ультразвуком в 70% этаноле в течение пяти минут, а затем стерилизуйте в 70% этаноле в течение 30 минут. После сушки титановых дисков поместите их в необработанную 24-луночную пластину и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру приготовленной клеточной суспензии. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе для получения макрофагов M0.
Для получения М1 поляризованных макрофагов добавляют интерферон гамма и липополисахарид в лунки 24-луночного планшета. Для поляризации М2 добавляют интерлейкин-4 и интерлейкин-13. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы вызвать поляризацию.
После получения поляризованных моноцитарных макрофагов из мононуклеарных клеток периферической крови человека, соберите клеточный надосадочный слой в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Перенесите титановый диск на новую 24-луночную пластину. Центрифугируйте надосадочную жидкость клетки при 300г в течение пяти минут и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку.
Измерьте цитокины и хемокины на 450 нанометрах в соответствии с конкретными инструкциями, предоставленными производителем. Рассчитайте концентрацию секретируемых цитокинов или хемокинов с помощью стандартной кривой. Измерьте общее количество белка с помощью набора для анализа белка бицинхониловой кислоты.
Нормализовать концентрацию секретируемых белков до миллиграммов общего белка. Дважды промойте поляризованные макрофаги в 800 микролитрах PBS. Инкубируйте диски в 400 микролитрах фиксирующего буфера в течение 20 минут при комнатной температуре.
После снятия фиксирующего буфера трижды промойте диски в 400 микролитрах PBS. Теперь инкубируйте диски с 400 микролитрами блокирующего буфера в течение 30 минут, чтобы заблокировать неспецифические участки связывания. Выбросьте блокирующий буфер и инкубируйте диски в течение одного часа с первичными антителами, разведенными в 400 микролитрах окрашивающего буфера.
Через час удалите первичные антитела и трижды промойте диски 400 микролитрами буфера для промывки. Добавьте фтор для меченых вторичных антител, разведенный в окрашивающем буфере, и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. После инкубации промойте образцы три раза в буфере для промывки в течение трех минут каждый.
Добавьте 10 миллимоляров DRAQ5 в PBS и инкубируйте в течение 15 минут в темноте. Затем удалите надосадочную жидкость и один раз промойте диски PBS. Добавьте одну каплю монтажного средства, а через пять минут нанесите защитные стекла и дайте образцам высохнуть в течение часа.
После высыхания заклейте края прозрачным лаком для ногтей. Чтобы получить общее представление о клетках, визуализируйте образцы на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе с 25-кратным увеличением. Измените увеличение на 63X, чтобы определить структуру и локализацию маркеров поверхности.
Первичные моноцитарные макрофаги были успешно поляризованы в макрофаги M1 и M2 на титановых поверхностях, при этом CCR7 сильнее экспрессировался в макрофагах M1, а CD209 — в макрофагах M2. Анализ qRT-PCR показал успешную поляризацию первичных моноцитарных макрофагов как на титановых, так и на покровных скользящих поверхностях с высокой экспрессией CCR7 и TNF-альфа для M1 и CD209 и CCL13 для M2. Высокие уровни воспалительного цитокина ФНО-альфа и хемокина CCL13 подтвердили поляризацию М1 и М2 на уровне белка.
