В этом исследовании была проведена хирургическая манипуляция по обнажению грудного отдела DRG у мышей под наркозом для визуализации кальция in vivo вместе с синхронизированной записью электрокардиограммы. Таким образом, мы пытаемся ответить, может ли иглоукалывание в PC6 на отверстии активировать нейрон DRG и одновременно регулировать электрокардиограмму. Методы, используемые в настоящее время в исследованиях иглоукалывания, включают электрофизиологию in vivo или vitro, нейронное отслеживание и различные стратегии в сочетании с оптогенетикой и хемогенетикой.
Визуализация кальция in vivo, представленная в этом исследовании, помогает лучше понять активность популяций нейронов DRG, индуцированных иглоукалыванием, на различных животных моделях, с помощью динамических записей и записей в реальном времени. Из-за физиологического искривления грудного отдела позвоночника на расстоянии от одного до пяти позвоночных сегментов грудной клетки довольно трудно обнаружить. Кроме того, влияние сердечного и легочного ритмов затрудняет фиксацию грудных ДРГ.
В противном случае провести дыхательную анестезию и поддерживать состояние мышей в течение нескольких часов непросто. Визуализация кальция in vivo выявляет активность конкретных популяций нейронов с помощью мышей с генной инженерией. Это первый случай, когда нейроны грудного отдела DRG были обнаружены in vivo.
Этот подход реализует наблюдение за нейронной активностью, вызванной соматической или висцеральной стимуляцией, а также за их перекрестными помехами. В нашей лаборатории разработаны методы визуализации кальция в грудном и поясничном отделах грудного и поясничного отделов грудного и поясничного отделов, и в будущем мы рассмотрим рецепторы, связанные с инициирующими факторами иглоукалывания, гиперчувствительностью акупунктурных точек, взаимодействием между стимуляцией соматической акупунктуры и висцеральными входами. После выполнения трахеотомии на мыши, находящейся под наркозом, поместите мышь в положение лежа на подогреваемую подушку.
Сделайте двухсантиметровый продольный разрез в центре затылка, простирающийся от шейных шести до грудных трех позвонков. Осторожно отделите жировые и спящие железы в передней части грудных позвонков мыши, избегая кровеносных сосудов под железами. Используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать кожу и мышечные слои, включая трапециевидную мышцу.
Вставьте ретрактор между мышцами, чтобы облегчить дальнейшее воздействие. Удалите мышцы, крепящиеся к головному зажиму, и прямую часть длинных мышц шеи, обнажив остистые отростки грудных двух. Сместите полуостные и спинные мышцы, чтобы обнажить дугу позвонка от С6 до Т3. Разрывают связь между пластиной дуги позвонка и суставным отростком грудной.
С помощью тонких щипцов тщательно удалите левый и правый суставные отростки и молочные отростки грудного. Очистите вышележащую соединительную ткань. Осторожно обнажите левый или правый грудной ганглий одного дорсального корешка, или DRG, убедившись в целостности эпиневриума на выбранной стороне.
Положите небольшой ватный тампон, смоченный в теплом физрастворе, над открытым DRG для поддержания влажности. Подключите монитор ЭКГ к отрицательному полюсу на правой верхней конечности, проводу заземления на правой нижней конечности и положительному полюсу на левой нижней конечности. Поместите мышь на столик из кастомного спинального зажима с помощью грелки.
Закрепите мышь с помощью двух зажимов, прикрепленных к суставным отросткам шейной шестерки и грудной тройки. Расположите спинномозговой зажим с закрепленной мышью под конфокальным микроскопом. Поместите воздушный объектив с большим рабочим расстоянием 10x/0,32 над открытой грудной клеткой 1 DRG.
Установите размер шага 25 микрометров и разрешение 512 на 512 или 1, 024 на 1, 024 пикселей. Отрегулируйте ось z ступени вверх и вниз и захватите всю грудную 1 DRG. Примените стимуляцию кистью к верхней конечности мыши и оцените реакцию нейронов DRG, на которых получено изображение.
Выполняйте стимуляцию периферических нервов при стимуляции PC6 с помощью стимулятора. В исходных условиях большинство нейронов в грудном отделе 1 DRG не проявляли флуоресценции GFP. Соматическая стимуляция приводила к быстрому и преходящему увеличению флуоресценции GCaMP с увеличением количества и интенсивности GFP.
Стимуляция периферических нервов при применении РС6 приводила к таким же изменениям флуоресценции ГКаМП, как и соматическая стимуляция. Нейроны были помечены и пронумерованы в пределах одного грудного 1 DRG после трассировки с помощью программного обеспечения для визуализации. Нейроны с изменениями интенсивности флуоресценции, превышающими 130% от порога F0, считались положительными ответами.
Гистограмма отображала различные диаметры нейронов, реагирующих на стимуляцию периферических нервов в PC6. Стимуляция периферических нервов при стимуляции PC6 показала увеличение частоты сердечных сокращений.
