末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録

この研究では、麻酔をかけたマウスの胸部DRGを露出させる外科的操作を導入し、同期心電図記録とともにin vivoカルシウムイメージングを行いました。これにより、孔のPC6での鍼治療がDRGニューロンを活性化し、同時に心電図を調節できるかどうかに答えようとします。現在、鍼治療研究で使用されている技術には、in vivoまたはvitroの電気生理学、神経追跡、および光遺伝学と化学遺伝学を組み合わせたさまざまな戦略が含まれます。

この研究で紹介されたin vivoカルシウムイメージングは、鍼治療によって誘発されるDRGニューロン集団の活動を、すべて異なる動物モデルで動的かつリアルタイムに記録することにより、より深く理解するのに役立ちます。胸椎の生理学的湾曲により、胸椎の1〜5つの椎体セグメントで、胸部DRGを露出させることは非常に困難です。さらに、心拍リズムと肺リズムの影響により、胸部DRGの固定が困難になります。

そうでなければ、マウスの呼吸麻酔と状態を何時間も維持することは容易ではありません。In vivoカルシウムイメージングは、遺伝子改変マウスを用いて特定のニューロン集団の活性を明らかにします。胸部DRGニューロンがin vivoで観察されたのはこれが初めてです。

このアプローチにより、体細胞刺激や内臓刺激による神経活動の観察と、そのクロストークの観察が可能になります。当研究室では、胸部・腰部重圧のin vivoカルシウムイメージング法を確立しており、今後は鍼治療の開始因子に関連する受容体、アキュポイントの過敏性、体細胞鍼治療刺激と内臓入力との相互作用について検討していきます。麻酔をかけたマウスで気管切開を行った後、マウスを加熱パッドの上で腹臥位に置きます。

首のうなじの中央に、頸部6椎骨から胸部3椎骨まで2センチメートルの縦切開を行います。マウスの胸椎の前面にある脂肪腺と冬眠腺を慎重に分離し、腺の下の血管を避けます。スプリングハサミを使用して、僧帽筋を含む皮膚と筋肉の層を切り開きます。

筋肉の間にリトラクターを挿入して、さらなる露出を助けます。ヘッドクランプに付着している筋肉と長い首の筋肉の直線部分を取り除き、胸部2の棘突起を露出させます。半棘筋と脊椎筋を変位させて、椎弓をC6からT3に露出させます。椎弓板と胸部の関節突起との間の接続を切断します。

細い鉗子を使用して、胸部の左右の関節突起と乳頭突起を細心の注意を払って除去します。上にある結合組織を取り除きます。左または右の胸部1背根神経節、またはDRGを慎重に露出させ、選択した側の神経上膜の完全性を確保します。

露出したDRGの上に温かい生理食塩水に浸した小さなコットンボールを置き、水分を維持します。ECGモニターを右上肢の負極、右下肢のアース線、左下肢の正極に接続します。マウスをカスタム脊椎クランプのステージに置き、加熱パッドで取り付けます。

頸部6と胸部3の関節突起に取り付けられた2つのクリップを使用してマウスを固定します。固定されたマウスで脊椎クランプを共焦点顕微鏡の下に配置します。10x/0.32 長距離飛行対物レンズを露出した胸部 1 DRG の上に置きます。

ステップ サイズを 25 マイクロメートル、解像度を 512 x 512 または 1, 024 x 1, 024 ピクセルに設定します。ステージのZ軸を上下に調整し、胸部1DRG全体をキャプチャします。マウスの上肢にブラシ刺激を加え、画像化されたDRGニューロンの応答性を評価します。

PC6刺激では、刺激装置を用いて末梢神経刺激を行います。ベースライン条件下では、胸部1 DRGのほとんどのニューロンはGFP蛍光を示さなかった。体細胞刺激は、GFPの数と強度の増加に伴って、GCaMP蛍光の急速かつ一過性の増加をもたらしました。

PC6適用時の末梢神経刺激は、体細胞刺激と同様のGCaMP蛍光の変化をもたらした。ニューロンは、イメージングソフトウェアで追跡した後、単一の胸部1 DRG内でマークされ、番号が付けられました。蛍光強度の変化がF0閾値の130%を超えるニューロンは、陽性反応と見なされました。

ヒストグラムは、PC6で末梢神経刺激に応答するニューロンの異なる直径を示しました。PC6刺激での末梢神経刺激は、心拍数の増加を示しました。