Терапия CAR-Т-клетками достигла беспрецедентных успехов в лечении некоторых патологических видов рака. В этом исследовании мы представили невирусный, долгоинтегрирующий подход к генерации транзиторных CAR-T-клеток и предоставили целевые процедуры для оценки функции CAR-Т-клеток. Наши исследования направлены на создание безопасных и эффективных CAR-Т-клеток с помощью более экономичного подхода.
CAR-Т-клетки обычно образуются в результате вирусной трансдукции. Ретровирусы и антивирусы являются наиболее распространенными вирусными векторами для доставки гена CAR. Производство вирусных векторов является сложным и дорогостоящим процессом, а вирусная трансдукция индуцирует случайную и постоянную интеграцию CAR-кодирующей ДНК в геном Т-клеток, что может вызвать проблемы с безопасностью.
Наш протокол предлагает невирусный подход к созданию CAR-Т-клеток, которые экспрессируют CAR только транзитивно. Этот метод использует мРНК для экспрессии CAR и использует электропорацию для доставки мРНК в Т-клетки. Он не имеет интеграции генов в геном Т-клеток, а производственные процедуры проще и экономичнее.
Для начала линеаризируйте ДНК плазмиды CAR с помощью фермента рестрикции BGL2 и выполните процедуру экстракции ДНК фенолхлороформом изоамиловым спиртом. После очищения линеаризованной ДНК проверьте размер и целостность матрицы с помощью электрофореза в агарозном геле. Для транскрипции in vitro смешайте компоненты реакции и инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее двух часов.
После транскрипции добавьте в реакцию два микролитра рибонуклеазы III, ДНКазы I. Аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы разрушить ДНК матрицы. Очистите транскрибированную мРНК CAR с помощью набора для очистки РНК и разведите ее в воде, не содержащей нуклеаз.
Измерьте концентрацию мРНК с помощью спектрофотометра перед хранением при температуре минус 80 градусов Цельсия. Разморозьте транскрибированный in vitro и очищенный образец автомобильной мРНК на льду. Суспендировать один раз по 10 в степени шести криоконсервированных мононуклеарных клеток периферической крови человека в одном миллилитре CAR-Т-среды.
Чтобы активировать Т-клетки, добавьте равное количество предварительно промытых гранул Т-активатора человека CD3/CD28. Культивируйте и расширяйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение нескольких дней. Добавьте один миллилитр CAR-T-среды на лунку в две лунки 12-луночного планшета и инкубируйте при 37 градусах Цельсия для уравновешивания.
Теперь перенесите пять раз по 10 в степень шести Т-клеток в стерильную трубку. Чтобы извлечь шарики CD3/CD28, поместите пробирку на магнитную подставку и осторожно наденьте клеточную суспензию в новую пробирку. Центрифугируйте пробирку при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре.
После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре стерильного PBS. Снова центрифугируйте пробирку и ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах неонового буфера Т. Смешайте пять микрограмм CAR MNA, разведенных в неоновом буфере Т, и 100 микролитров клеток в общем объеме 125 микролитров. Добавьте 25 микролитров Неонового буфера Т к оставшимся 100 микролитрам клеток, который служит отрицательным контролем.
Установите систему электропорации Neon на 1 800 вольт, 10 миллисекунд и один импульс. С помощью неоновой пипетки отсасывайте смесь мРНК CAR Т-клеток в неоновый наконечник объемом 100 микролитров и электропорируйте клетки. Немедленно перенесите электропорированные клетки в уравновешенную питательную среду в 12-луночном планшете и верните планшет в инкубатор для расширения клеток до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
Извлеките Т-клетки, трансфицированные мРНК CAR, для проточного цитометрического анализа уже через шесть часов после электропорации. Смешайте CAR-Т-клетки несколько раз с помощью пипетки и перенесите хотя бы один раз по 10 в степени пяти клеток в пятимиллилитровую пробирку для сортировки флуоресцентных клеток, или FACS. Добавьте в пробирку три миллилитра холодного промывочного буфера и центрифугируйте пробирку при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре.
После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах промывочного буфера. Добавьте два микролитра флуоресцентно меченого антитела для обнаружения и семь красителей жизнеспособности AAD к взвешенным клеткам. Перемешайте образец и инкубируйте его на льду в течение 30 минут, избегая воздействия света, затем промойте клетки тремя миллилитрами холодного промывочного буфера и снова центрифугируйте пробирку при 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре.
После отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах промывочного буфера и немедленно проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра. Удалить среду из опухолевых клеток, экспрессирующих антиген CAR на поверхности клетки. Промыв клетки PBS, инкубируйте их с одним миллилитром 0,05%-ного раствора трипсина ЭДТА в течение одной минуты при 37 градусах Цельсия, затем приготовьте одиночную клеточную суспензию в соответствующей питательной среде с плотностью от одного до пяти умножденных на 10 в размере пяти клеток на миллилитр.
Затем добавьте 50 микролитров предварительно нагретой среды для культуры опухолевых клеток в E-пластину и поместите ее в инструмент для анализа клеток в реальном времени или RTCA для измерения фонового импеданса, затем добавьте по 100 микролитров суспензии опухолевых клеток в каждую лунку и уравновесьте планшет при комнатной температуре в течение 30 минут. Поместите E-пластину обратно в прибор RTCA и контролируйте индекс ячейки в течение 24 часов, измеряя его каждые пять-15 минут. На следующий день приготовьте суспензию CAR-Т-клеток.
Приостановите запись индекса ячейки и снимите E-пластину с прибора RTCA. Слегка наклоните планшет и осторожно удалите 50 микролитров питательной среды из каждой лунки, не нарушая опухолевые клетки, затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров CAR-Т-клеток или контрольных Т-клеток. Верните E-plate в прибор RTCA и возобновите мониторинг индекса ячейки в течение как минимум 24 часов, выполняя сканирование каждые пять-15 минут.
Остановите мониторинг клеточного индекса и проанализируйте результат цитотоксичности. Для анализа секреции цитокинов перенесите надосадочную жидкость из каждой лунки в круглое дно или V-образный 96-луночный планшет. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре и осторожно перенесите надосадочную жидкость в новый 96-луночный планшет.
Наконец, измерьте уровни цитокинов в надосадочной жидкости с помощью коммерческих наборов ИФА. Последовательность мРНК CAR была проверена как имеющая размер около двух килооснований с помощью гель-электрофореза. Более 50% активированных Т-клеток экспрессировали CAR в первый день после электропорации, увеличиваясь до более чем 70% на второй день, прежде чем снизиться примерно до 10% к пятому дню.
CAR-Т-клетки показали значительную цитотоксичность в отношении HER2-положительных опухолевых клеток SK-OV-3, о чем свидетельствует резкое снижение импеданса опухоли, в то время как контрольные Т-клетки продемонстрировали минимальный эффект. Высокие уровни секреции интерферона гамма были обнаружены в культуральной среде CAR-T-клеток, но не в контрольной группе.
