Сбор экзосомы обогащенной кондиционированной среды из клеток, обучтенный в биореакторных колбы и изоляции сахарозной подушкой ультрацентрифугации, приводит к экзосомной подготовке высокой урожайности с минимальными загрязняющими белками или не экзосомными пузырьками. Использование одной подушки сахарозы, приготовленной в оксиде дейтерия, обходит трудоемкий препарат градиента сахарозы и уменьшает количество сахарозы, необходимое для достижения необходимой плотности. Эффективная экстракорпоральная доставка siRNA инкапсулирует в экзосомах, подготовленных в этом протоколе подчеркивает потенциал этой системы в качестве нового поколения РНК-интерференционной терапии рака поджелудочной железы.
Начнем с того, что культура HEK-293 клетки в нормальной среде, как описано в рукописи. Расширьте клетки на четыре колбы T75 и расти до тех пор, пока они не достигнут 90% слияния. Чтобы подготовить биореакторную колбу, добавьте от 50 до 100 миллилитров нормальной среды в средний резервуар колбы биореактора, чтобы промокнуть мембрану.
Соберите все клетки HEK-293 из четырех колб T75 и повторно посовещите их в 15 миллилитров экзосомы истощенной среды в центрифуге трубки. Затем используйте 20-миллилитровый шприц, подключенный к тупой игле, чтобы аккуратно добавить эту клеточную подвеску в клеточный отсек биореакторной колбы. Затем заполните средний резервуар колбы биореактора нормальной средой, до 500 миллилитров, и инкубировать его при 37 градусах Цельсия, 5%CO2 в течение недели.
После одной недели инкубации, удалить все среды из среднего резервуара биореактор колбы, выливая его. Используя 20-миллилитровый шприц, подключенный к тупой игле, удалите всю среду из клеточного отсека. Затем добавьте от 50 до 100 миллилитров нормальной среды в средний резервуар и 15 миллилитров свежей экзосомно истощенной среды в клеточный отсек с помощью 20-миллилитрового шприца, подключенного к тупой игле заполнения.
Затем заполните средний резервуар колбы биореактора нормальной средой до 500 миллилитров. Инкубация при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2 в течение еще одной недели. Чтобы предварительно очистить собранную кондиционированную среду, центрифугировать ее при 500 раз г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Перенесите супернатант в новую трубку и выбросьте гранулы. После повторения этого шага центрифугации с восстановленным супернатантом, восстановить супернатант снова и отказаться от гранул. Затем центрифуга восстанавливается супернатант на 2000 раз г в течение 15 минут и четыре градуса по Цельсию.
Держите супернатант, и отбросить гранулы. Фильтр супернатант один раз через 22-микрометровый фильтр, прикрепленный к 20-миллилитровому шприцу, в свежую центрифугу. Между тем, чтобы подготовить 25% раствор сахарозы в оксиде дейтерия, точно вывесить 1,9 грамма сахарозы в универсальной трубке.
Затем добавьте оксид дейтерия, пока вес не достигнет 7,6 грамма. Затем заполните ультрацентрифугную трубку 22,5 миллилитров предварительно очищенной кондиционированной среды. Поместите стеклянную пипетку в трубку.
Добавьте три миллилитров раствора сахарозы через пипетку так, чтобы раствор образует отдельный слой под условным носителем. Аккуратно поместите трубку, содержащую многослойный условный раствор средней/сахарозы, в ведро ротора. Закрести ведро в роторе.
Поместите ротор в ультрацентрифуг, и спина на 100000 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение 1,5 часов. Соберите два миллилитров слоя сахарозы из трубки, один миллилитр за один раз с помощью P1000 пипетки, с его кончиком прилагается к 10-микролитр отзыв, и добавить его в ультрацентрифуг бутылку, содержащую 20 миллилитров фильтрованных PBS для мытья. Поместите трубку в ротор с фиксированным углом и центрифуга на 100 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 1,5 часов.
Используйте 10-миллилитровую серологическую пипетку, чтобы тщательно удалить супернатант. Повторное распределение гранул с 400 микролитров фильтрованных PBS. Перед началом электропорации, предварительно охладить электропорации cuvette на льду в течение 30 минут.
Смешайте семь микрограммов экзосом с 33 микрограммами siRNA в микроцентрифугной трубке. Добавьте буфер лимонной кислоты для достижения объема в 150 микролитров. Добавить экзосому-siRNA смесь электропорации cuvette с помощью пластиковой пипетки, и крышка cuvette.
Поместите кювет в правильную ориентацию в держатель кювета электропоратора и поверните поворотное колесо электропоратора на 180 градусов по часовой стрелке. Выберите нужную программу и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать электропорацию. Дисплей будет указывать на успешный пульс.
Затем поверните колесо на 180 градусов против часовой стрелки и удалите кювет. Используйте пластиковую пипетку, чтобы удалить образец из кювета в новую трубку микроцентрифуга. Держите трубку на льду или в холодильнике перед дальнейшей обработкой, если не использовать немедленно.
Чтобы начать свободное удаление siRNA, пройти 3,5 миллилитров фильтрованных PBS через столбец хроматографии размера дважды, чтобы уравностороть его. Затем растворите 150 микролитров электропотерного образца в 350 микролитров фильтрованных PBS и перенесите их в колонку SEC. Соберите первую 500-микролитровую фракцию, вытертую из колонны в трубку микрофуза, и отметь ее как F0. Затем добавьте в столбец 500 микролитров фильтрованного PBS.
Соберите следующую фракцию и отметь ее как F1. Повторите добавление PBS и сбор фракций элюции до тех пор, пока в общей сложности 10 500-микролитровых фракций, или до F9, не будет собрано. Наконец, чтобы удалить остатки образцов, помойте столбец фильтрованным PBS по крайней мере дважды, а затем продолжить эксперименты, как описано в рукописи. Морфологический анализ с использованием электронной микроскопии передачи показал, что экзосомы HEK-293 были сферическими структурами, немного большими, чем 100 нанометров.
Этот результат согласен с тем, что от наночастиц отслеживания анализа измерения, который также показал распределение размера экзосом. Кроме того, они были положительными для экзосомных маркеров CD81, CD9 и CD63. Процентное восстановление экзосом, очищенных с помощью хроматографии исключения размера, и процентное восстановление siRNA были рассчитаны, как описано в рукописи.
После очистки восстановления экзосомы было 75% Использование siRNA стандартной кривой, инкапсуляция эффективность siRNA в экзосомы было рассчитано, чтобы быть около 10 до 20% Поток цитометрии качественный анализ поглощения в пробирке экзосомы загружены флуоресцентными Atto655-siRNA показали, что PANC-1 клетки, обработанные siRNA-encapulated exosomes был самый большой в сдвиге. Это было подтверждено выводом о том, что клетки PANC-1, обработанные инкапсулированными экзосомами siRNA, зафиксировали более высокий процент положительного населения для сигнала Atto655 по сравнению с теми, которые обрабатываются выгруженными экзосомами и смесью siRNA. Клеточное поглощение siRNA было также значительно более высоко в клетках PANC-1 обработанных siRNA-инкапсулированными exosomes сравненными с тем обработано с смесью exosome-siRNA, подтверждая что siRNA-инкапсулированные exosomes были интернализированы клетками PANC-1 и что они эффективно поставляют siRNA внутриклеточно.
Важно очень точно взвесить сахарозу и оксид дейтерия при подготовке раствора сахарозы и всегда использовать свежеприготовленный раствор сахарозы, чтобы избежать изменения плотности во время хранения. Конфокаленная микроскопия может быть проведена для дальнейшей проверки интернализации siRNA инкапсулированных в экзосомах в клетки и изучения его внутриклеточной торговли после клеточного поглощения. Этот протокол позволяет нам оценить ген-специфический нокдаун siRNA поставленный exosome и служит как инструмент для новой проверки цели в ТЕРАПИИ рака RNA interference-основанной.
