Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Двигательные расстройства исследования в лаборатории была поддержана Бахман-Стросс дистонии и Паркинсона фонд, Соединенные Паркинсона Фонда, американский Паркинсона Болезнь ассоциации, Болезнь Паркинсона Ассоциации Алабама, Майкл Дж. Фокс Фонд исследований болезни Паркинсона, и Undergraduate Research.

Выражение плазмиды Строительство Два плазмид требуются: одна для тканеспецифические экспрессии гена интересов и второй, как селективный маркер трансформации. Экспериментальные плазмиды <ol><li> Выберите промоутер, что выражается в ткани / элемент тип интереса, например, нерва или мышцы конкретных промоутера. Если кто-то выразить нескольких генов в той же ткани, промоутер кассету плазмиды в шлюзе системы (Invitrogen) могут быть использованы. Такой подход позволяет вставлять любой ген интереса ниже по течению от промотора рекомбинационной 4 клонирования. Правило, 2-5 кб предшествующих последовательностей достаточно иметь правильные и точные выражения. </li><li> КДНК гена может быть клонирован двумя способами: <ol><li> Обычные клонирования использованием ферментов рестрикции. </li><li> Для клонирования шлюз, это ПЦР усиливается использованием праймеров, содержащих шлюз ATT B рекомбинационной последовательности. Усиливается кДНК первой объединить в pDONR201 доноров вектора, чтобы создать запись вектор, а затем превращается в E. палочки штамма DH5a. После выбора успешных рекомбинантов и мини-приготовительные изолирования ДНК, вступление вектор объединить в промоутер содержащих назначения вектор для создания выражения плазмиды. Подробности о рекомбинационной клонирования можно получить либо ручной шлюз Invitrogen или в Колдуэлл и соавт. 5. </li></ol></li></ol> Выбор Маркера плазмиды Примеры трансгенных плазмид маркер включают РОЛ-6 или использование мышц стенки тела промоутер UNC-54 для управления флуоресцентными экспрессии белка. Эти плазмиды маркера, как правило, доступны из научно-исследовательского сообщества по запросу. Микроинъекции Элеганс C. Подготовка <ol><li> Выполните выделения ДНК из двух плазмид, которые должны быть введены. Количественно их и смешать в соотношении 1:1 на 50 нг / мкл. </li><li> Подготовка агара лап: <ol><li> Сделайте 2% агарозном раствора в воде, тепло или микроволновой печи до полного растворения. </li><li> Изложить несколько 22 х 50 мм стекла крышка на настольный. </li><li> С помощью пипетки Пастера, поместите каплю расплавленной агарозы на одной обложкой стекло и сразу же место второй стакан крышку над падение на 90 углом к ​​первой. Повторите несколько других стекол крышку. Диаметр уплощенной диск агарозы должна быть в пределах 15-20 мм. </li><li> После агарозном укрепил (это займет всего моментов), снимите крышку стекла и позволяют площадку высохнуть полностью (несколько часов, чтобы на ночь). </li><li> Хранить прокладки в окно стеклянной крышкой при комнатной температуре. </li></ol></li><li> Сделать иглы погрузчиков ДНК решение: Иглы погрузчики создаются из 100 мкл капиллярной трубки, которые нагреваются в среднем на открытом огне и быстро вытащил примерно в два раза их длины. Две половинки привязываются друг от друга раз капиллярная трубка охлаждается. Запасами 10-20 иглы погрузчики для инъекций. Магазин в вертикальном положении в стойку трубки микроцентрифужных. Будьте осторожны, чтобы не прокалывать себе на очки. </li><li> Сделать микроинъекции игл: Игла изготовлена ​​из специального капилляра, который содержит внутренние нити стекла, нити этого служит фитиля для раствора ДНК. Эти тянут на иглу-съемник машины. Мы используем Narishige PP-830 Съемник с тепловой установки 24.8. Некоторые иглы потянул время и хранятся в небольшой пластиковой коробке. Несколько иглы могут быть легко «установлена» на полосу пластилин для долгосрочного хранения. </li><li> Иглы &quot;выключатели&quot;: Кончике иглы микроинъекции вытягивается так хорошо, что это фактически закрыта в конце этого и должен быть взломан с помощью небольших осколков покровного стекла. Эти подготовленные упаковки 18 х 18 мм защитное стекло в бумажное полотенце и осторожно нажимая пока он разбивается на несколько частей. Осколки полезных размер примерно 3 х 4 мм. </li><li> Расти дикого типа (N2) червей ранней стадии взрослой для инъекций с использованием стандартных процедур 6. Подготовка около 100 правильно поставил черви / построить вводили. </li></ol> Процедура <ol><li> Откройте основной клапан на бак гелия, который подключен к руке микроинъекции иглой и держателем. Закройте регулирующий клапан, чтобы газ, чтобы войти в линию, в результате чего давление до 35 атм. Обратите внимание, что газ может быть выпущен использованием педали. </li><li> Вставьте иглу погрузчика в стандартной трубы pipetter рот (находится в контейнерах стеклянные капилляры) и составить небольшое количество смеси плазмиды (~ 1 мкл). </li><li> Иглы погрузчика осторожно помещают в задней части инъекционной иглы и аккуратно вставляется весь путь до конца длинуиглу, пока не почувствуете сопротивление. Выгнать раствора ДНК, мягко дует, а затем удалить загрузчик. </li><li> Вставьте иглу в микроинъекции руку, стараясь, чтобы поместить его в небольшой внутренний резиновую прокладку. </li><li> Место иглы нарушение осколок покровного стекла на одном краю агар площадку. Обложка осколок, а также всей поверхности агара площадку, с галоидоуглеводородов нефти. Место агар накладка на стадии инвертированного микроскопа. </li><li> Расположите иглу в центр поля зрения использования 4X объективных и яркое освещение поля, но до сих пор не опустите его в масло. Кроме того, положение внутреннего края осколок покровного стекла в центре, затем сосредоточиться на нем (еще используют 4X цель). Опустите иглу в нефти, приведение его в той же фокальной плоскости, как осколок покровного стекла. Поднимите увеличение за счет перехода на 40Х цели. Переориентация на краю осколка и положение кончика иглы, если это необходимо. </li><li> Чтобы открыть до кончика инъекционной иглой, осторожно подталкивать иглу к краю покровного стекла осколок, и в то же время применение короткого импульса газа через ножную педаль. Иглы будет достаточно взломан, когда маленькие капельки жидкости побега конце иглы. Избыток жидкости потока из-за слишком большого открытия не желательно, так как он будет убивать животных. </li><li> Удалить агар площадку со сцены, поднимая иглу, но не меняют X-или Y-ось позиции. Слайд этапе из-под иглы, удалить агар площадку и разместить его на вскрытии микроскопом. Передача червя на панель, ниже поверхности нефти. Если червь извивается, нежно поглаживать его, пока он контактов агар площадку. Влажной червь должен придерживаться сухой агарозы. </li><li> Инъекция <ol><li> Быстро место обратно агар площадку на сцену, центрирования червя в поле зрения. </li><li> Опустите иглу в той же плоскости, в фокусе, как червь. </li><li> Переключатель фильтров для освещения Хоффман (тип контраста фильтра). Это позволяет морфологическая деталь червя становятся видимыми. Если Номарского / DIC оптики можно найти на перевернутый масштаб, который будет работать также. Использование 40X цели, сосредоточиться на &quot;зернистым&quot; синцитиальный центре червь гонады, ниже &quot;сотовый&quot; узор ростка ядер (выбрать в зависимости от того гонады расположен на стороне червя перед иглой). </li><li> Точная настройка положения иглы до кончика также находится в фокусе (той же плоскости, гонад &quot;зернистости&quot;). </li><li> Осторожно введите иглу в центре гонады и применять короткого импульса давления газа изгнать капля или две ДНК в гонады руку. Вы должны наблюдать волну жидкости распределены по дистальной гонады. Не думайте, что больше жидкости, лучше, так как слишком много жидкости может поступать в проксимальных изгиб гонады руки, которые могут закрыть ооцитов производства. Если это возможно, в зависимости от положения червя, ввести другую руку гонады в том же порядке. </li><li> Важно, чтобы работать быстро, в результате употребления инъекционных червя, так как она может легко пересушивает. Решение придать второе плечо гонад зависит от того, насколько быстро вы можете повторно положение иглы и червя. Весь процесс в идеале должны принимать не более 1-2 минут. </li></ol></li><li> Снимите крышку стекла со сцены и поместите его на вскрытии области. Применять 1 мкл М9 буфера (22 мм KH 2 PO 4, 42мм Na 2 HPO 4, 85 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4) непосредственно на вводили червя (это может повлечь за собой погружение кончика пипетки от поверхности галоидоуглеводородов нефти). Буфер должен увлажняет червя, он будет плавать от поверхности агарозном площадку. Передача червя регулярные пластины с использованием червя выбор. Площадку агарозы можно повторно использовать еще несколько раз, пока не стало слишком насыщенным буфера и червей не придерживаться. </li></ol> Трансгенные выбор <ol><li> Введенный червей, P 0 поколения, перечисляемых на индивидуальные свежие, бактериально посеяны пластины (60 мм) и позволила воспроизвести. Как правило, вводят животным инкубируют при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится. </li><li> F 1 потомства наблюдаются на наличие трансгенной маркер (например, флуоресценции) при помощи флуоресцентного стереомикроскопа. Каждый люминесцентные, перевозчик F 1, животное отдельно клонирована на новую пластинку (так как потомство от каждого F 1 рассматриваются различные линии). F 1 гермафродитов допускаются к размножению. Опять же, это, как правило, осуществляется на при 20 ° С в течение 2-3 дней, пока потомство появится. </li><li> F 2 поколения наблюдается у трансгенных животных, а также. F 2 животных, которые унаследовали и выразить трансгенных массива считаются «стабильный» линии. ПРИМЕЧАНИЕ: В F 1-йвозраст может быть много трансгенных животных, но они не являются стабильными. Большинство F 1 трансгенных животных, не будут распространяться на F 2 устойчивых линий. ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля за изменчивости числа копий гена, создавать не менее трех независимых стабильных линий на построить вводили. </li><li> Каждый независимый стабильный линия должна быть сохранена в качестве отдельной строкой червей. Каждая строка может распространяться путем передачи нескольких трансгенных животных для новой пластинкой в ​​каждом поколении, что должно быть выполнено с использованием флуоресцентного стереомикроскопа если выбор маркера флуоресцентные. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы: - Вводят непосредственно в центре гонады - Не вводить слишком много жидкости - Работать быстро, чтобы предотвратить высыхание. Если у вас возникли проблемы с иглой, такие, как он сломан слишком большой, то лучше переделать свежей иг...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Трансгенные Caenorhabditis Элеганс может быть легко создан с помощью микроинъекции ДНК плазмиды раствора в гонады 1. ДНК плазмиды перестраивает сформировать внехромосомными concatamers, которые стабильно наследуются, хотя и не с такой же эффективностью, как фактическое хромосомы 2. Интересующего гена совместно вводили очевидным фенотипических маркеров, таких как РОЛ-6 или GFP, чтобы отбор трансгенных животных при вскрытии микроскопом. Экзогенного гена может быть выражена от его родного промоутер для сотовых исследования локализации. Кроме того, трансгенов может быть вызвано различными тканеспецифические промоутер для оценки роли продукта гена в данной клетки или ткани. Этот метод эффективно диски экспрессии генов во всех тканях C. Элеганс, за исключением половых или раннего эмбриона 3. Создание трансгенных животных широко применяется для целого ряда экспериментальных парадигм. Это видео демонстрирует микроинъекции процедуры для создания трансгенных червей. Кроме того, подбор и обеспечение стабильной трансгенных C. Элеганс линии описывается.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection at JoVE.com

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Это видео демонстрирует технику микроинъекции в гонаде C. Элеганс для создания трансгенных животных.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

52.6K Views.  University of Alabama. Это видео демонстрирует технику микроинъекции в гонаде C. Элеганс для создания трансгенных животных.

Video: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Микроинъекция А. Эмбрионы aegypti получить Трансгенные комары

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Активация апоптоза Цитоплазматическая Микроинъекция цитохрома С</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Измерения воздействия бактерий на<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Поведение использованием анализа Яйцо Сохранение

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Создание трансгенных<em&gt; Hydra</em&gt; По эмбрионов микроинъекции

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Исследуя распространение и токсичности прионами как белков с использованием многоклеточных животных модельного организма<em&gt; C. Элеганс</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...