Мы благодарим естественных наук и факультет искусств и наук в Королевском университете для финансирования этой работы. Кроме того, мы благодарим Чин-Санг лабораторию для предоставления необходимых реагентов, оборудования и технической поддержки. Мы также благодарим QGEM 2011 году, особенно Тони Он за его вклад в дискуссию.

1. Подготовка / стиральная черви <ol><li> Синхронизация червей молодых взрослых 11. </li><li> Пипетки 2 мл базальной S на 5 см Хемотаксис тарелку поставил червей, которые только что очистили газон OP50 Е. палочки. Наклоните пластины мере необходимости для обеспечения червей промывают с поверхности пластины в буфер. </li><li> Внесите 1 мл червя-S базальной решение в микроцентрифужную трубки. </li><li> Центрифуга в течение 10 сек использованием PicoFuge при 6600 оборотах в минуту. </li><li> Аспирируйте базальной S, оставляя осадок червей нетронутыми. </li><li> Добавьте 1 мл раствора базальной S в микроцентрифужных трубки, инвертировать несколько раз мыть червей. </li><li> Повторите шаги 1,4 до 1,6 еще три раза. </li><li> Центрифуга в течение 10 сек пятый раз, на этот раз аспирации супернатант до конечного объема прибл. 100 мкл. </li><li> Внесите 2 мкл червей на NGM пластины чтобы у пассажиров было от 50 до 250 червей в каждом 2 мкл образца. Регулироватьконцентрация червей в базальных S мере необходимости ресуспендированием червей в меньшем или большем объеме базальной S. </li><li> Используйте червей в анализе сразу после мытья червей на срок до 1 часа. </li></ol> 2. Подготовка тестовых планшетов <ol><li> Маркировка нижней пластине 5 см, разделите блюдо на 4 равных квадранта. Агар хемотаксиса или NGM могут быть использованы. Минимум 3 испытания требуются в генетическое напряжение проходит испытания. </li><li> Отметить окружности радиусом 0,5 см вокруг начала координат (рис. 1). </li><li> Отметьте точки в каждом квадранте либо с &quot;T&quot; для &quot;Test&quot; или &quot;C&quot; на &quot;Управление&quot;, гарантируя, что сайты находятся на одинаковом расстоянии от начала координат и друг друга. Точек должно быть не менее 2 см от начала координат. Отметить верхний левый и нижний правый квадранта в качестве тест-квадранта и в верхнем правом и нижнем левом квадрантах в качестве контроля (рис. 1). </li></ol> 3. Проведения анализа </P&gt; <ol><li> Смешать исследуемого раствора путем объединения равных объемах тестируемого соединения и 0,5 М азид (анестезии, чтобы арестовать червей при достижении квадрант). Смешать контрольного раствора путем объединения растворитель, используемый для разбавления тестируемого соединения с 0,5 М азида. </li><li> Пипетка 2 мкл червь раствор (полученный в 1.8) из осадка на происхождение (где пересекаются две линии). </li><li> Сразу же после пипетки 2 мкл испытуемого раствора на две &quot;Т&quot; сайтов. Кроме того, пипетки такое же количество контрольного раствора на две &quot;С&quot; сайтов. </li><li> Как только червь и одоранта капли были поглощены в агар, заменить крышки и инвертировать пластин. </li><li> Через 60 мин поместить червей в 4 ° C инкубатора. Только снимите пластину из инкубатора, когда он может быть подсчитаны. Оставив черви при комнатной температуре может позволить им мобилизовать снова. </li><li> Запишите количество червей в каждом квадранте, что полностью пересек внутренний контурLe. </li><li> Повторите этапы 3,2 до 3,6 использованием контрольного раствора в обеих испытуемых и контрольных квадрантах. Это будет служить в качестве контрольной пластины. Три таких пластин должны быть сделаны и работают в качестве надлежащего контроля. </li></ol> 4. Интерпретируя результаты / определения индекса хемотаксиса <ol><li> Расчет индекса хемотаксиса с помощью уравнения 1. Это приведет к хемотаксическими индекса от -1,0 до +1,0. </li></ol> (1) Индекса хемотаксиса = (# Черви в обоих тестовых Квадранты - # Черви в контрольной Квадранты) / (# Всего Червей забил) Оценка 1,0 указывает максимальное привлечение к цели и представляет 100% от червей прибывающих в квадрантах содержащие химические цели. Индекс -1,0 свидетельствует о максимальной отталкивания. Подобные методы анализа уже были использованы 3 (Таблица 1). <ol start="2"><li> Сообщить о средней Chemotaxiс индекса (CI) и стандартной ошибки среднего (SEM). Выполните Стьюдента тест сравнении данных испытуемых и контрольных пластин. </li></ol>

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Хемотаксиса, хотя контролируется комплексом нейронов и клеточные механизмы, может быть легко и объективно количественно с помощью хемотаксиса. Для получения наилучших результатов анализов, некоторые важные шаги должны быть приняты. Во-первых, постановка червей имеет важное значение ...

Уорд впервые разработана хемотаксиса в 1973 году 5, и с тех пор она имела далеко идущие приложений. Нейробиологии одно поле, что выиграл от использованием разнообразных хемотаксиса. Обонятельная адаптация, простой формы обучения и памяти, была продемонстрирована в C. Элеганс использованием хемотаксиса 6. Они также показано, что C. Элеганс этанола может развиваться толерантность результат, который не только демонстрирует поведенческую пластичность червей, но это также показывает, что черви могут быть очень полезны в изучении алкогольной зависимости у людей 3. Анализы даже были разработаны, чтобы продемонстрировать способность C. Элеганс для хранения краткосрочной и долгосрочной памяти, показав, что ассоциации сделаны червей между хемоаттрактанты и продукты питания (OP50) 7. Кроме того, учитывая обширную в настоящее время информация о C. Элеганс генома, chemotaxiс поведением C. Элеганс была изменена много раз путем индукции мутаций 1,8. Это позволяет много интересных возможностей техники, таких как развитие C. Элеганс как биологическая очистка инструмента. Таким образом, с момента первоначального развития анализа хемотаксиса в 1973 году, она была изменена и часто используется для выяснения тайн в различных дисциплинах. Некоторые анализы направленные выявить конкретные пути следования червей к цели. Прототипом анализ такого рода был разработан Ward 5. Три черви были размещены на расплавленный агар в течение 15 мин. Их движения были прослежены отпечаток они оставили на их пути от периферии пластины вверх градиента аттрактанта в центре пластины. Все червей на пластине были задержаны с использованием хлороформа в конце каждого испытания. Один потомок этого метода помещен одного червя в середине пластины с аттрактант и контрольт равными и противоположными расстояние от начала координат 2. Pierce-Shimomura соавт. разработали анализ наблюдать точный характер движения, участвующих в хемотаксис 9. Индивидуальные червей помещали в 9 см чашки Петри, содержащие либо единой концентрации аттрактанта или радиальную форму градиент, что привело к источнику аттрактанта. Компьютерной программы, которая признала червь был использован для записи наблюдаемого поведения. Видеокамера прикреплена к микроскопу работал совместно с этапом для регулировки чашку Петри автоматически анализа управлял обеспечить червь оставались в поле зрения. Исходя из этого, более подробная информация была обнаружена относительно причины пируэты отображается C. Элеганс. Другие анализы, более похожий на тот, описанный здесь, испытаны реакции большая популяция червей испытуемых соединений. Два квадранта хемотаксиса былииспользуются для изучения роли, которую различные нейроны, рецепторы, и молекулы передачи сигнала, подаваемого при C. Элеганс подвергают воздействию различных соединений 1. В период 20-50 промытого червей были помещены вблизи центра пластины с аттрактант и контроль на полярных концах вместе с анестетиком, азид натрия (NaN 3). Через 60 мин хемотаксический индекс со значениями от -1,0 до +1,0 был сгенерирован на основе разницы между количеством червей были прикреплены к аттрактант или управления. Аналогичный показатель хемотаксическими был использован в анализе сообщается в этой статье, хотя ранее анализа не удалось строго оценить неподвижные червей. Этот анализ был затем далее применительно к тестирования эффектов нейронов абляции на хемотаксис. Другой вариант вышеупомянутого Анализ проводили где 100-200 червей были помещены в центр пластины, содержащей четыре квадранта 3. Квадранта или содержатся в тесте иликонтрольного вещества. Как и в предыдущих анализах, черви не могли двигаться под действием азида натрия, прежде чем забил. Аналогичный способ описан здесь как способ оценки отклика С. Элеганс различных соединений. Тем не менее, ниже метод имеет дополнительное преимущество только оценки червей, которые прошли порог расстояния, отделяющего от мобильного неподвижными червей. Другие анализы включили аналогичных руководящих принципов для игнорирования неподвижными червей. Frøkjær-Йенсена и др.. разработали универсальный анализа, который может быть использован для тестирования как энергозависимые, так и водорастворимые соединения 10. Чашку Петри была разделена на четыре квадранта. Верхний и нижний квадранты не содержит растворителей. Левом квадранте содержал воду, а также право содержащихся аттрактанта. При тестировании летучих одорантов, аналит был помещен на крышку чашки, в течение надлежащего квадранте, тогда как водорастворимые соединения помещали непосредственно на агаR. Методы существующей в настоящее время для оценки хемотаксиса ответ С. Элеганс постоянно совершенствуются для оптимизации их простоты использования, эффективности и точности. Таким образом, в то время как анализ, описанный здесь, имеет возможность оценки наибольшего количества червей (максимальная пропускная способность:. 250 черви / час на тарелку, немного больше, чем пропускная способность продемонстрировано Ли и др. 3); реальную силу этого метода сжатый кульминацией многих из атрибутов ранее анализа (табл. 1).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoFuge</td>
 <td>Stratagene</td>
 <td>400552</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscopes</td>
 <td>Leica</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting</td>
 <td>Leica</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000 Pipette</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P10 Pipette</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M Sodium Azide</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol/Distilled Water</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>166-0600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4Cl</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>CA97062-046</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA12001-120</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NH4OH</td>
 <td>BDH</td>
 <td>CABDH8641-2</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Tween 20</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-6531</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

c. elegans chemotaxis assay

Многие организмы используют хемотаксисе искать источники пищи, избегать вредных веществ, а также найти партнеров. Caenorhabditis Элеганс имеет впечатляющие поведения хемотаксиса. Помещение за тестирование реакции червей одоранта, чтобы разместить их в районе, и наблюдать за движением вызвало в ответ на одоранта. Даже с учетом многих доступных анализов, оптимизация червь местонахождение относительно контрольных и испытательных площадок, при сведении к минимуму взаимодействие червей друг с другом, при сохранении значительных размеров образец остается незавершенное 1-10. Описанный здесь метод направлен на решение этих вопросов, изменив анализа разработанных Баргман и соавт. 1. Чашку Петри разделена на четыре квадранта, два противоположных квадрантах с пометкой &quot;Тест&quot; и два обозначены &quot;Контроль&quot;. Обезболивающий размещается во всех исследуемых и контрольных сайтов. Черви помещаются в центре пластины с Circlэлектронной отмечены вокруг начала координат, чтобы неподвижные черви будут игнорироваться. Используя четырехквадрантные система, а не один или два 2 +1 исключает предвзятость в движение червей, так как они находятся на одинаковом расстоянии от опытных и контрольных образцов, независимо от того, с какой стороны от происхождения они начали. Это обходит проблему червей вынуждена путешествовать через кластер других червей, чтобы ответить на одоранта, которые могут задержать червей или заставить их принять более кружным путем, что дает неверное толкование их намеченного пути. Этот метод также показывает практические преимущества, имеющие больший размер выборки и позволяет исследователю для запуска анализа без присмотра и забить червей раз за отведенное время истекло.

Сравнение дикого типа (N2) С. Элеганс в УСО-10 (KY10) мутанта. Мы использовали диацетил, известный C. Элеганс хемоаттрактант, сравнивать дикого типа червей, что и мутант, который не хватает рецепторов Диацетил 1,12. Для дикого типа (N2) червей хемотаксически?...

Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

C. elegans Chemotaxis Assay

Метод количественной оценки хемотаксического ответа<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Описан. Хемотаксическими индекс (СИ) был использован как способ точно оценить реакцию червей определенные цели, а также служить в качестве платформы для сравнения между штаммами и соединений, представляющих интерес.

C. Элеганс Анализ хемотаксиса

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

45.0K Views.  Queen's University. Метод количественной оценки хемотаксического ответа Caenorhabditis Элеганс Описан. Хемотаксическими индекс (СИ) был использован как способ точно оценить реакцию червей определенные цели, а также служить в качестве платформы для сравнения между штаммами и ?...

Video: C. elegans Chemotaxis Assay

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Разбор и запись с Junction C. Elegans нервно-мышечной

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Метод для культивирования эмбриональных<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Клетки

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Измерения воздействия бактерий на<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Поведение использованием анализа Яйцо Сохранение

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...