病毒诱导的基因沉默（VIGS）烟草benthamiana和番茄

摘要

病毒诱导的基因沉默（VIGS）的基因表达击倒在方法的说明烟草benthamiana和西红柿。

摘要

RNA干扰（RNAi）是一个非常具体的的由双链^RNA 1引发的基因沉默的现象。这沉默机制使用RNA的监管的两大类：小分子RNA，这是从非蛋白质编码基因和短干扰RNAs（siRNAs）。植物利用RNAi技术来控制转座子和发挥对发育过程中，如花器官的形成和叶的^发展 2,3,4的严格控制。植物也利用RNA干扰抵御感染病毒本身。因此，许多病毒已经进化的基因抑制基因沉默，让他们成功定植其主机^5。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种方法，它利用植物RNAi介导的抗病毒防御机制。在未修改病毒感染的植物的机制是专门针对病毒的基因组。然而，与病毒载体携带来自宿主基因的序列，这个过程可以额外针对相应的主机的mRNA。 VIGS已适应高通量功能基因组学在植物使用的植物病原农杆菌提供，通过其Ti质粒，重组病毒携带整个或部分沉默针对性的基因序列。全身病毒的传播和内源性植物RNAi的机械，其余的照顾。相应的靶基因的dsRNAs生产，然后到21至24个核苷酸的siRNA的核糖核酸酶Dicer的切割。这些siRNAs最终指导的RNA诱导的沉默复合体（RISC）降解目标成绩单^2。

在VIGS已采用不同载体和最常用的是基于对烟草脆裂病毒（TRV）。 TRV是一个双边的病毒，正因为如此，两个不同的答农杆菌株用于VIGS。其中一个进行pTRV1，而另一方面，pTRV2，港口的外壳蛋白和用于^VIGS 6,7序列编码的病毒复制和运动功能。接种benthamiana烟草和番茄幼苗混合两种菌株在基因沉默的结果。内源性的八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的基因，这将导致漂白，沉默是用来作为VIGS的效率控制。但是，应该指出，在番茄的沉默通常小于 N中的有效benthamiana。应始终感兴趣的基因的RNA转录本丰度测量，以确保有效地被下调的靶基因。然而，从北外源基因序列benthamiana可以用他们各自的同源基因沉默番茄，反之亦然^8。

研究方案

第1部分：植物材料

本生烟沉默使用的植物应约2个半周龄时，子叶和第2 - 4片真叶出现。番茄（ 白毛lycopersicum）植物7 - 8天的出现，片真叶时尚未出现。

第2部分：VIGS

第1天

1. 对于每一个实验中，农杆菌窝藏pTRV1，pTRV2，pTRV2 PDS和pTRV2主机靶基因是生长在LB琼脂板与卡那霉素50微克/毫升和100微克/毫升利福平补充。卡那霉素的选择，而利福平这样做的农杆菌pTRV质粒。 2天，在30 ° C孵育板。
   PDS的沉默会导致植物的光漂白和作为一个沉默的效率控制使用。此外，必须克隆到一个pTRV2载体的基因被下调。有网关兼容pTRV2可能有助于克隆的载体，是由刘等人的描述。 （2002年）。

第3天

1. 接种2 - 3毫升与上述每一株抗生素的LB液体培养。晃动在30 ° C孵育16 - 18小时和200 RPM

第4天

1. 接种1：到次要的液体诱导培养基（IM），与卡那霉素，利福平和200微米的乙酰丁香酮（表1，2和3）IM文化，小学文化25稀释。乙酰丁香酮是用来作为一种必需的，而在IM模拟的环境，这种病菌遇到主机质外体的T - DNA ^转移 到植物9农杆菌vir区基因的诱导。孵育，在30 ° C震动20 - 24小时和200 RPM

第5天

1. 收获的细胞，离心10分钟，3000 × G.悬浮在相同体积与10毫米MgCl _2的 10毫米MES的pH值5.5，原有的文化。细胞可能是轻轻振荡，以重悬。
2. 再次为10分钟3000 × G. Centrifugue细胞重悬在半原始文化的音量氯化镁10毫米，10毫米的MES pH值5.5。
3. 每个细菌培养一种细菌悬浮液，准备与外径_为 0.3 600。添加乙酰丁香酮的终浓度为400微米pTRV1文化。
4. 包含pTRV1 pTRV2在1比1的比例（或含有目的基因的pTRV2）混合的文化。还包括一个pTRV2 - PDS控制。请注意，最后的乙酰丁香酮的浓度是现在的200微米，每一种文化是一个外径₆₀₀ 0.15。
5. 标签要保持沉默的基因和实验日期渗透苗。
6. 到每个渗入叶用针戳一个孔。使用1毫升不必要的注射器，渗透到幼苗的菌悬液。番茄，渗透子叶同时为N。 benthamiana，最大的两个片真叶渗透。五毫升每个细菌混合，应足以渗透到15 N 。 benthamiana和25个番茄幼苗。改变，不浇水，直到接种后的第二天植物之间的渗透和手套，以避免交叉污染。
7. 植物都保持在20 - 22 ° C的增长与一个每天16小时的长度和50％RH至少3个半星期之前，他们可能会使用检测室。

第3部分：代表结果

图1显示了一个代表性的实验与 N benthamiana和番茄植株适用于PDS沉默。植物漂白表型特征，观察植物的减少数量的类胡萝卜素。对于PDS沉默的对照植株，漂白开始被看作是尽快为1 ½周后渗透。

图1。PDS控制基因沉默的原因在本生烟（A）和番茄（二）植物漂白。照片是3个半星期后的沉默。

表1。诱导培养基（IM）的制备。

400毫升	蒸馏水2 O
4.88摹	MES（2 - （4啉）乙烷磺酸）
2.5摹	血糖
0.12摹	的NaH 2 PO 4

带上一个DH _{2 O的}最终体积475毫升，并调整pH值至5.6 。高压灭菌器。介质冷却下来后，添加25毫升20X AB盐。

表2。AB盐的制备。

20克	NH 4 CL
6摹	硫酸镁4 · 7H 2 O
3摹	氯化钾
0.2克	氯化钙
0.05摹	FESO 4 · 7H 2 O

带至终体积为1升蒸馏水。高压灭菌。要知道，AB盐作为一个橘黄色粉末沉淀。只要将它们混合以及通过其使用前旋转。

表3。乙酰丁香酮的制备的200毫米。请注意，乙酰丁香酮，应准备的一天，它将被用来。

19.6毫克	乙酰丁香酮（3'，5' -二甲氧基-4' - 羟基苯乙酮）
500μL，	DMSO（二甲基亚砜）

讨论

病毒诱导的基因沉默是一种方法，允许快速反向遗传筛选。它避免了新一代的T - DNA或转座子介导的基因敲除，这是只有在某些植物如拟南芥和玉米。它也避开了厂房改造耗时的过程，并允许针对多个基因在同一时间，只要他们有足够的同源性¹⁰或不同的主机上的靶序列，同时安排在沉默^载体6，11 。

然而，沉默是没有100％有效，因此，必须小心解释结果...