אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Summary

מחקר זה מתאר את האבחנה של שפעת העופות בעופות בר באמצעות מערכת ניידת rRT-PCR. השיטה מנצלת מיובשים בהקפאה ריאגנטים למסך ציפורי בר בסביבה הלא במעבדה, תרחיש טיפוסי של התפרצות. שימוש בכלים מולקולריים מספק חלופות מדויק ורגיש לאבחון מהיר.

Abstract

ציפורי בר היו מעורבים התפשטות שפעת העופות מאוד פתוגניים (HPAI) של תת סוג H5N1, שגרם מעקב לאורך flyways נודדות. דגימה של ציפורי בר וירוס שפעת העופות (AIV) מתנהל לעתים קרובות באזורים נידחים, אבל התוצאות הן לעתים קרובות מתעכב בשל הצורך להעביר דגימות למעבדה מצויד לבדיקה מולקולרית. בזמן אמת transcriptase הפוכה polymerase תגובת שרשרת (rRT-PCR) היא טכניקה מולקולרית המציע אחת השיטות המדויקות ביותר ורגישה לאבחון של AIV. פרוטוקולים המעבדה קפדנית בעבר הדרושים rRT-PCR כיום להיות מותאמים עבור השדה. פיתוח של חומרים כימיים מיובשים בהקפאה (lyophilized) שאינם דורשים שרשרת קר, עם רגישות ברמה של ריאגנטים רטוב הביא באתר בדיקות מרחוק מטרה מעשית.

כאן אנו מציגים שיטה לאבחון מהיר של AIV בעופות בר באמצעות יחידת rRT-PCR (מכשיר מתקדם Ruggedized זיהוי הפתוגן או RAPID, איידהו טכנולוגיות, סולט לייק סיטי, יוטה) המעסיקה ריאגנטים lyophilized (1 שפעת יעד TaqMan; ASAY -ASY-0109, איידהו טכנולוגיות). ריאגנטים להכיל את כל המרכיבים הדרושים לצורך בדיקות בריכוזים המתאימים שפופרת אחת: primers, בדיקות, אנזימים, מאגרים בקרות פנימיות חיוביות, ביטול שגיאות הקשורות אחסון לא נכון או טיפול של ריאגנטים רטוב. יחידה ניידת מבצע מסך לשפעת על ידי מיקוד הגן מטריצה ​​והתשואות תוצאות 2-3 שעות. Subtyping גנטית אפשר גם עם פריימר H5 ו - H7 קובע כי היעד של הגן hemagglutinin.

המערכת הוא מתאים לשימוש על דגימות ביוב ו הלוע התחתון שנאספו ציפורי בר, כפי שהודגם כאן על מינים נודדים shorebird, ביצנית המערבי (Calidrus mauri) כבשו בצפון קליפורניה. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לזרז את האבחון של ציפורי בר, ​​להגדיל את הסיכויים של המכיל התפרצות במיקום מרוחק. באתר אבחנה גם להיות שימושי עבור זיהוי לומדים אנשים נגועים באוכלוסיות הבר. ההזדמנות לאסוף מידע על הביולוגיה מארח (בתגובה החיסונית לזיהום פיזיולוגיים) ואקולוגיה מרחבית (ביצועים הנדידה של עופות נגועים) יספק תובנות המידה שבה ציפורי בר יכולים לשמש וקטורים עבור AIV על פני מרחקים ארוכים.

Protocol

1. ציפור ללכוד Wild באמצעות רשתות ערפל

1. עבור ללכוד shorebird, להקים רשתות ערפל באתר ליקוט פעיל כגון ביצה, קו החוף, או בוץ שטוח.
2. קו שקופיות מכמורת לולאות בקצה אחד של הרשת ערפל סביב הקוטב והכנס מוט אנכית לתוך הבוץ.
3. למתוח את הרשת, להוסיף מוט השנייה ועד מכמורת לולאות בסוף אחרים נטו ערפל אנכית להכניס מוט לתוך הבוץ, מוודא כי קווי מכמורת לומדים.
4. לאחר ציפור בשבי, לחלץ את הציפור נטו ולחזור לתחנת banding.

2. ביוב הדגימה ספוגית

1. איסוף דגימות ביוב מיד לאחר לכידת
2. אתר את הביב ולהשתמש בקצות האצבעות להדוף הנוצות שמסביב
3. לגולל דקרון או סטריליים פוליאסטר שקצהו ספוגית, גזע סוף הראשון, להרטיב את קצה עם סטרילי התקשורת התחבורה ויראלי להקל יותר בניקוי. לאחר הרטבה, הראש כולו ספוגית מוכנס בעדינות לתוך הביב. ספוגית היקף הפנימי של הביב ידי לאט מסובב את ספוגית ולהסיר את ספוגית מן הביב.
4. החדרת קצה ספוגית ישירות את הבקבוקון ויראלי תחבורה התקשורת מדגם: לסובב את פיר ספוגית בין האגודל לאצבע בזמן ספוגית היא בתקשורת. האם עוזר להשלים את ההליך על ידי משיכת קצה האחורי ספוגית מהחלק התחתון של המכל ~ 1 ס"מ וחותכים את הפיר של ספוגית עם זוג מספריים כך קצה ספוגית נשאר בקבוקון ואת הפיר לא להפריע כובע הסגר. שווי בקבוקון בחוזקה. לחטא את המספריים עם אלכוהול חיתוך בין פירים ספוגית.
5. מניחים את צלוחיות במקפיא בקופסה המכילה או קרח יבש או שקיות קרח.

3. דגימה הלוע התחתון ספוגית

1. בעדינות לפתוח במקורה של הציפור כך חריץ choanal גלוי
2. לגולל ספוגית נקייה מהחבילה, גזע סוף הראשון, להרטיב את קצה עם התקשורת התחבורה ויראלי להקל יותר בניקוי
3. מבלי לגעת טיפ לכל משטחים אחרים, להכניס אותו לתוך הפה ספוגית הפתיחה choanal על גג הפה וממשיכים לעבר האזור הלוע התחתון או בגרון
4. הניחו את קצה ספוגית ישירות את הבקבוקון תחבורה התקשורת ויראלי. סובב את מוט ספוגית בין האגודל לאצבע בזמן ספוגית היא בתקשורת. לעיל, יש עוזר למשוך את קצה הגב ספוגית מהחלק התחתון של המכל ~ 1 ס"מ וחותכים את הפיר של ספוגית עם זוג מספריים כך קצה ספוגית נשאר בקבוקון ואת הפיר אינו מתערב עם כובע הסגר. שווי בקבוקון בחוזקה. לחטא את המספריים עם אלכוהול חיתוך בין פירים ספוגית.
5. מניחים את צלוחיות במקפיא בקופסה המכילה קרח יבש או שקיות קרח.

4. ציפור טיפול ושחרור

1. חזור ציפור לאתר של ללכוד לשחרר במועד (<20mins). המפעילים צריכים להיות מודעים לעקרונות של רווחת בעלי החיים ולהיות ערניים לסימנים של ציפור סבל במהלך הדגימה (שריטות כלומר, ללכוד מיופתיה ו תת או היפרתרמיה). ערכת עזרה ראשונה בסיסית צריך להיות כלול ברשימת הציוד.

5. בדיקת מתקני

1. דוגמאות ניתן לבדוק בשטח כל סגורים כגון הקרוואן מחקר או באוהל, עם ספק כוח (מתח, מוסדר מחולל חשמל) כדי להפעיל את יחידת ה-PCR ואת המחשב המחובר.

6. RNA מיצוי

1. מיצוי RNA בוצעה עם ערכת מיני RNeasy עם שינויים קלים הוראות היצרן הבאים Spackman ואח' ^1.
2. וורטקס ספוגית בינוני של 3-5 ולהעביר 350 μl לצינור microcentrifuge 2 מ"ל. הערה: שמור על מדגם יתר על הקרח במקרה PCR חיובי דגימות צריך להיות rescreened או מבחן H5 צריך לרוץ.
3. הוסף 350 μl של חיץ RLT (עם β-לי) ו מערבולת של 5 s.
4. הוסף 350 μl של אתנול RNA 70% בכיתה.
5. צנטריפוגה XG ב 5000 עבור 5 דקות.
6. הוסף 600 μl של supernatant לעמודה ספין להציב צינור אוסף 2 מ"ל. לשמור על מדגם שנותרו מתלה מבחנה.
7. צנטריפוגה עבור s 20 ב XG 10,000 וזורקים זרימה דרך.
8. חזור על שלבים 17-18 עד שכל מדגם כבר עבר עמודה ספין.
9. מקום בעמודה ספין צינור נקי אוסף 2 מ"ל.
10. הוסף 700 μl של חיץ RW1 לעמודה ספין צנטריפוגה 25 s ב x 10,000 g. מחק את הזרימה דרך.
11. הוסף 500 μl חיץ הרשתית לעמודה ספין צנטריפוגות עבור s 25 ב 10,000 x ז מחק את הזרימה דרך.
12. חזור על שלב 22 עבור סכום כולל של שני שוטף עם חיץ הרשתית.
13. צנטריפוגה העמודה ספין עבור 2 דקות נוספות על 14,000 x ז בטל צינור איסוף.
14. מניחים את הטור ספין צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל ולהוסיף מים 50μl nuclease חינם. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 s.
15. Elute RNA על ידי ספינינג עבור s 60 ב xgf 10,000 או 60 s. המקום מטוהרים מדגם על הקרח.

7. הכנת שולטת שלילי

1. ריאגנטים Lyophilized היו מוכנים לשימוש assay PCR בהתאם להוראות של ערכת טכנולוגיות איידהו מיובשים בהקפאה איתור מגיב לשפעת בדיקות TaqMan יעד 1 (ASAY-ASY-0109).
2. צנטריפוגה שליטה שלילי מגיב בקבוקון (אדום) עבור ר 3 כדי להבטיח כדורי נמצאים בתחתית.
3. הסרת כובע, ויזואלית לעשות כדורי בטוח נמצאים בתחתית.
4. הוסף 20 μl של הצפת X 2 ו - 20 הכינון מים μl כיתה מגיב.
5. Recap ו מערבולת במשך 5 שניות במהירות המרבית.
6. צנטריפוגה עבור 3 s להביא נוזל לתחתית של הבקבוקון.
7. ראייה לבדוק גלולה יש rehydrated, אם לא חזור על שלבים 31-32.
8. פיפטה 19 μl של התייבשות התערובת לתוך צינור Lightcycler נימי, חזור על שלב פיפטה לתוך נימי השני לקבל כפולים.

8. בדיקת דגימות הכנת

1. צנטריפוגה את הבקבוקון מגיב לא ידוע (כחול) במשך 3 שניות על מנת להבטיח כדורי נמצאים בתחתית.
2. הסרת כובע, ויזואלית לעשות כדורי בטוח נמצאים בתחתית.
3. הוסף 40 μl של מטוהרים RNA.
4. Recap ו מערבולת במשך 5 שניות במהירות המרבית.
5. צנטריפוגה עבור 3 s להביא נוזל לתחתית של הבקבוקון.
6. ראייה לבדוק גלולה יש rehydrated, אם לא חזור על שלבים 38-39.
7. פיפטה 19 μl של התייבשות התערובת לתוך צינור Lightcycler נימי, חזור על שלב פיפטה לתוך נימי השני לקבל כפולים.

9. הכנת שולטת חיובית

1. צנטריפוגה הביקורת החיובית מגיב בקבוקון (ירוק) עבור ר 3 כדי להבטיח כדורי נמצאים בתחתית.
2. הסרת כובע, ויזואלית לעשות כדורי בטוח נמצאים בתחתית.
3. הוסף 20 μl של הצפת X 2 ו - 20 הכינון מים μl כיתה מגיב.
4. Recap ו מערבולת במשך 5 שניות במהירות המרבית.
5. צנטריפוגה עבור 3 s להביא נוזל לתחתית של הבקבוקון.
6. ראייה לבדוק גלולה יש rehydrated, אם לא חזור על שלבים 45-46.
7. פיפטה 19 μl של התייבשות התערובת לתוך צינור Lightcycler נימי, חזור על שלב פיפטה לתוך נימי השני לקבל כפולים.

10. Centrifuging צינורות נימי

1. לאחר שכל הצינורות נימי עבור אצווה הוכנו לטעון אותם לתוך צנטריפוגה במיני מצויד במתאמי נימי.
2. צנטריפוגה בהגדרה הנמוכה ביותר על ידי לחיצה על כפתור הדופק למטה 1 s. זה העברות נוזל לתחתית לקראת הבדיקה.

11. הפעלה מהירה

1. ליצור קובץ חדש. לייבל בקרה חיובית, שליטה שלילי, דוגמאות (על ידי מספר תעודת הזהות שלהם).
2. תוכנית 1: הכנת RNA החזק לדוגמא
   1. מחזורי = 1
   2. מצב = ניתוח אף
   3. טמפרטורה Target = 40
   4. זמן דגירה = 30 דקות
   5. מעבר טמפרטורה שיעור = 20 ° C / s (ברירת המחדל)
   6. מטרה משנית טמפרטורה = 0 (ברירת המחדל)
   7. גודל שלב = 0 (ברירת המחדל)
   8. עיכוב שלב = 0 (ברירת המחדל)
   9. מצב רכישת = אין (ברירת המחדל)
3. תוכנית 2: RNA denaturation
   1. מחזורי = 1
   2. מצב = ניתוח אף
   3. טמפרטורה Target = 94
   4. זמן דגירה = 120s
   5. מעבר טמפרטורה שיעור = 20 ° C / s (ברירת המחדל)
   6. מטרה משנית טמפרטורה = 0 (ברירת המחדל)
   7. גודל שלב = 0 (ברירת המחדל)
   8. עיכוב שלב = 0 (ברירת המחדל)
   9. מצב רכישת = אין (ברירת המחדל)
4. תוכנית 3: הגברה RNA
   1. מחזורי = 45
   2. מצב ניתוח = ניתוח אוטומטי
   3. טמפרטורת היעד, במגזר 1 = 94; קטע 2 = 60
   4. זמן דגירה, קטע 1 = 0 s, קטע 2 = 20 s
   5. מעבר דרג טמפרטורה, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (ברירת המחדל)
   6. טמפרטורת היעד המשני, Seg 1 & 2 = 0 (ברירת המחדל)
   7. גודל שלב, Seg 1 & 2 = 0 (ברירת המחדל)
   8. עיכוב שלב, Seg 1 & 2 = 0 (ברירת המחדל)
   9. מצב רכישה, קטע 1 = none; קטע 2 = אחד
5. Fluorescence פרמטרים
   1. מצב תצוגה: ערוץ פלואורסצנציה 2 (CH2 / 1)
      רווחים:
      1. פרק 1 (F1) = 1
      2. פרק 2 (F2) = 8
      3. פרק 3 (F3) = 1
   2. כדי להציג את נתונים בזמן אמת הקרינה עבור כל דגימה, בחר מדגם של עניין ללחוץ על הלחצן 'הצג גרף "בחלק התחתון של המסך
6. עבור כל נימי, התוצאות כוללות את הפעולות הבאות:
   • # - מזהה את המיקום של הקרוסלה הקרוסלה
   • שם לדוגמה - מספק את השם של המדגם
   • הבקרה - indentifies סוג המדגם עבור כל דגימה
   • ציון - מחושב באמצעות הקשר בין הקרינה של מדגם את רמת הקרינה רקע במדגם
   • התוצאה - מציג את התוצאה הכוללת למדגם

12. נציג התוצאות:

> תוצאות אפשריות כוללות:
היום: לקרוא "מתנה" אדום לבדיקה / מדגם לא ידוע מציין כי היעד זוהה לדוגמה ושולטת היו מוצלחים.
לא מזוהה: "לא זוהה" ירוק קוראים לבדיקה / מדגם לא ידוע מציין כי היעד לא זוהה לדוגמה ואת שולטת הבדיקה היו מוצלחים.
בבקשה חוזר: "אנא חזור" עולה כי השליטה חיובי או שלילי נכשל.

דוגמה של ניתוח מוצלח על ידי RAPID 7200 מוצג באיור 4. השליטה חיובי מוגבר ויוצר הקרינה לזיהוי (ציר y) על כ 25 מחזורים (ציר x). סף מחזור (CT)> 35 הוא חתך הסכימו רוב המעבדות AIV התייחסות. לכן, שולטת חיובית עבור שיטה זו הפיקה אות ניאון בתוך מספר המקובל של מחזורים (0-35) לגילוי AIV. לעומת זאת, הביקורת השלילית אינה מייצרת אות ניאון גם אחרי 45 מחזורים. בדומה לכך, עשר דגימות שנאספו לביצניות המערב לא ליצור אות ניאון המציין כי העופות היו שליליות עבור AIV. מעקב ובדיקה של כל הדגימות החיוביות במעבדה המסורתית מומלץ לוודא כי אין תוצאות חיוביות שגויות מיוצרים בטעות.

1. איור Shorebird ללכוד באמצעות רשתות ערפל.

איור 2. איסוף דגימות ביוב ו הלוע התחתון של לפחות לביצניות.

איור 3. תכנות 7200 RAPID עבור הגברה RNA.

איור 4. Fluorogram שנוצר על ידי RAPID 7200 נייד rRT-PCR מראה איך בקרות חיוביות ושליליות אמור להופיע assay מוצלח. לחץ כאן כדי להציג את התמונה בגודל מלא

Discussion

שיטת אבחון מהיר המוצג כאן מאפשר בדיקה זמן יעיל ומדויק של דגימות צפור פראית למעקב של AIV. אחסון הרבה פחות מחמירים הדגימה דרישות ניידים rRT-PCR מתאים למצבים מרוחקים שבהם תחזוקה של רשת קר עשוי להיות מעשי אם משלחים חנקן נוזלי או קרח יבש אינו זמין. בנוסף, מצאנו כי ניתוח דגימה עם...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
טור RNeasy מיני ספין	Qiagen	74106	כלול בערכה מיני RNeasy
אוסף צינורות (1.5 & 2 מ"ל)	Qiagen	74106	כלול בערכה מיני RNeasy
מאגר RLT	Qiagen	74106	כלול בערכה מיני RNeasy
מאגר RW1	Qiagen	74106	כלול בערכה מיני RNeasy
מאגר הרשתית	Qiagen	74106	כלול בערכה מיני RNeasy
RNase ללא מים	Qiagen	74106	כלול בערכה מיני RNeasy
14.3 M β-mercaptoethanol פתרון	פישר סיינטיפיק	BP176100
100% אתנול	פישר סיינטיפיק	NC9602322
וורטקס Genie 2, 120V	תעשיות מדע	Si-0236
TaqMan שפעת יעד 1 (Probe הידרוליזה)	איידהו טכנולוגיות	ASAY-ASY-0109
Lightcycler צינורות נימי 20ml	רוש ומדע יישומי	04929292001
מיקרו צנטריפוגות עם הכתף של 2 צינורות מ"ל	איידהו טכנולוגיות		כלול בערכה RAPID
זיהוי Ruggedized מתקדם התקן הפתוגן (RAPID) 7200	איידהו טכנולוגיות		כלול בערכה RAPID
פנטיום מבוססי מחשב נייד עם Windows XP Professional	איידהו טכנולוגיות		כלול בערכה RAPID
Lightcycler ניתוח נתונים תוכנה	איידהו טכנולוגיות		כלול בערכה RAPID