Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Resumo

Variação fenotípica para características podem resultar de mutações em cis-regulatórias elemento (CRE) seqüências que controlam os padrões de expressão gênica. Métodos derivados para uso em Drosophila melanogaster pode comparar quantitativamente os níveis de padrões espaciais e temporais de expressão genética mediada por variantes modificadas ou que ocorre naturalmente CRE.

Resumo

Padrões de expressão gênica são especificados por cis-regulatórias elemento (CRE) seqüências, que são também chamados enhancers ou cis-regulatórias módulos. A CRE típico possui um arranjo de sítios de ligação para proteínas de transcrição vários fatores que conferem uma lógica de regulamentação especificando quando, onde e em que nível o gene regulado (s) é expressa. O conjunto completo de CREs dentro de um genoma animal codifica programa do organismo para o desenvolvimento de ^um, e empírica, bem como estudos teóricos indicam que mutações nos CREs desempenhou um papel proeminente na evolução morfológica ^2-4. Além disso, estudos do genoma humano largo da associação indicam que a variação genética nas CREs contribuir substancialmente para a variação fenotípica ^5,6. Assim, a compreensão da lógica de regulação e como as mutações afetam essa lógica é um objectivo central da genética.

Transgenes repórter fornecer um método poderoso para estudar a função in vivoção de CREs. Aqui, um conhecido ou suspeito seqüência CRE é acoplado ao promotor heterólogo e seqüências que codificam um gene repórter que codifica para uma proteína de produtos facilmente observáveis. Quando um repórter transgene é inserido em um organismo hospedeiro, a actividade do CRE se torna visível na forma da proteína codificada repórter. P-elemento transgênese mediada na mosca da fruta Drosophila espécies (D.) melanogaster ⁷ tem sido usada há décadas para introduzir transgenes repórter para este organismo modelo, embora a colocação de genômica de transgenes é aleatória. Assim, a atividade do gene repórter é fortemente influenciada pela cromatina local e do ambiente gene, limitando comparações CRE para ser qualitativa. Nos últimos anos, o sistema de integração baseado phiC31 foi adaptado para uso em D. melanogaster para inserir transgenes em sítios específicos do genoma ^10/08 pouso. Esta capacidade fez a medição quantitativa do gene e, relevante aqui, a atividade CRE ^13/11 feasible. A produção de moscas de frutas transgênicas podem ser terceirizados, incluindo phiC31 integração baseada, eliminando a necessidade de comprar equipamentos caros e / ou ter proficiência em protocolos de injeção especializados transgene.

Aqui, apresentamos um protocolo geral para avaliar quantitativamente uma atividade CRE, e mostrar como essa abordagem pode ser usada para medir os efeitos de uma mutação introduzida em uma atividade CRE e comparar as atividades das CREs ortólogos. Embora os exemplos dados são de um ativo CRE durante a metamorfose de frutas voar, a abordagem pode ser aplicada a outros estágios de desenvolvimento, as espécies de mosca da fruta, ou organismos modelo. Em última análise, uma utilização mais generalizada desta abordagem para CREs estudo deve avançar a compreensão da lógica de regulação e como a lógica pode variar e evoluir.

Protocolo

Visão geral:

Este vídeo demonstra um protocolo capaz de medir quantitativamente as atividades gene regulador para o cis-regulatórias elemento (CRE) sequências em Drosophila melanogaster (D.). Este protocolo pode ser usado para comparar as atividades de regulação possuído por: tipo selvagem e formas mutantes CRE, de ocorrência natural CRE alelos encontrados dentro de uma espécie, ou CREs ortólogos entre as espécies divergentes.

1. Site-specific integração de transgenes repórter na Drosophila melanogaster genoma

Reporter A. construção transgene

1. Como primeiro passo, qualquer CRE deve ser avaliado separadamente clonados em um vetor que contém um repórter (1) attB seqüência bacteriana local anexo usado para site-specific a integração do transgene ^11/08, (2) sítio múltiplo de clonagem de um montante (3) promotor heterólogo que é seguido pela seqüência (4) que codifica para uma fluorescenteproteínas (como EGFP ou DsRed).
2. Embora qualquer vetor pode ser compatível para phiC31 mediada site-specific de integração através da introdução de uma seqüência attB no backbone do vetor, o vetor pS3aG12-14 pode ser obtido a partir do repositório addgene plasmídeo (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG é uma versão personalizada da transformação P-base vector15 em que um dos dois isoladores cigana foi substituído por um isolante SfIb, ele contém um sítio de clonagem múltipla melhorada, e possui uma seqüência de 250 pares de bases contendo um local de ligação attB. CREs de interesse são inseridos no sítio múltiplo de clonagem upstream de um promotor hsp70 mínimo eo gene EGFP que codifica uma versão melhorada da proteína verde fluorescente que localiza para o núcleo.

B. integração site-specific de transgenes repórter

1. Para um conjunto de CREs, cujas actividades estão a ser comparard como parte de vetores transgene repórter, os vetores são criados separadamente integrados no mesmo local de pouso genômica. Aqui, a proteína integrase fago phiC31 catalisa a recombinação unidirecional entre o local de ligação bacteriana (attB) no vetor de transgene e um fago genomicamente localizado (attP) site anexo ^9. Vários grupos ^8-11 fizeram uma variedade de linhagens transgênicas que incluem um site attP (sites chamados de pouso) e contém uma fonte de genômica ⁸ de phiC31 que expressa essa proteína nas células germinativas. Estes estoques mosca pode ser facilmente obtidos a partir da Drosophila Bloomington estoque centro (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
2. Um protocolo publicado existe detalhando como criar transgênicos Drosophila local especificamente usando phiC31 integrase ^16. Os equipamentos e conhecimentos técnicos para fazer transgênicos Drosophila lines não é mais necessária como vendedores existem diversas (Tabela 1), a quem este serviço pode ser terceirizado.
3. Comportamento transgene pode variar muito de um tecido para os ¹¹ próximos. Assim, um local de pouso única attP não é o ideal para a análise de todas as CREs, estágios de desenvolvimento, e / ou tecidos de estudo. É aconselhável para avaliar a atividade de uma CRE de interesse em vários locais de destino diferente, a fim de encontrar um local onde a atividade da CRE é representativo do gene alvo endógena (s) padrão de expressão.
4. Para obter linhagens transgênicas é aconselhável fazê-los homozigotos para o transgene. CRE atividade é geralmente mais robusta em indivíduos com duas cópias do transgene e para medições quantitativas, é imperativo que as comparações são feitas entre indivíduos com o mesmo número de cópias do transgene. Homozigotos podem ser obtidas através do uso de cromossomos balanceador. Para locais de pouso bem caracterizada, porém, é muitas vezes simpler para coletar os machos e as fêmeas virgens, e cruzar aquelas com o fenótipo mais intensa cor dos olhos conferidas pelo gene da mini-branca (Fig. 1), com o resgate branco mutante desde pelo vetor transgene integrado é mais dramática em indivíduos com dois vetores cópias.

2. Espécimes obtenção ou tecidos do estágio apropriado de desenvolvimento

Obter amostras para análise no momento em desenvolvimento, quando o padrão de expressão do gene (s) de interesse ocorrer (s) endogenamente, portanto, o tempo quando o CRE sob investigação deve ativar a expressão do gene repórter. Para Drosophila, este pode ser embrionário, larval, pupa ou adulto. Abaixo descrevemos um método para estágio moscas adultas e metamórficas, o último dos quais ocorre dentro do pupário, a pele dura larval que contém a amostra imóvel até que ecloses como um adulto.

1. Expandir as linhas de transgênicos para garantir SPECIMens do palco adequado estão disponíveis quando estiver pronto para analisar a expressão de gene repórter por microscopia confocal. Criação de dois frascos, cada um com vários (~ 5-10) moscas macho e fêmea. Em dias alternados, bump as moscas de um dos frascos a um tubo não utilizado. Repita isso por uma semana. Ao final de duas semanas, moscas de frutas transgênicas estarão disponíveis, que vão desde larval ao adulto estágios de desenvolvimento.
2. Staging moscas adultas: A duração do tempo gasto dentro de um pupário é de 98 horas para mulheres e 102 horas para os homens, quando criados a 25 ° C. Moscas adultas podem ser facilmente coletadas quando eles emergem do pupário (chamado de eclosão). Este ponto no tempo pode ser considerado 0 eclosão pós horas. Moscas adultas podem ser criados até o ponto no tempo necessário para análise. Por exemplo, um CRE chamado mel-œ1 que controla a expressão do gene desatF na oenocytes adultos de D. melanogaster fêmeas não está ativo imediatamente após a eclosão mas a atividade CRE switches depois de um dia ^14. Quando a fase correta é obtida, anestesiar moscas e situar em uma gota de óleo Halocarbon em um slide e proceda à avaliação confocal.
3. Staging espécimes durante a metamorfose: No final do estágio larval third-instar o pupário é formado. Apesar de nesta fase o animal tecnicamente ainda é uma larva de terceiro instar, nesta fase de desenvolvimento é facilmente identificável como a amostra é não-móvel, o pupário é macio e branco, e dos espiráculos têm evertido (Fig. 2A). Este ponto no tempo pode ser considerado 0 horas após a formação pupário (hAPF). Nesta fase, os machos podem se distinguir das fêmeas pela presença de gônadas bilateralmente situado perto do ponto médio do corpo que aparecem como círculos translúcida (boxed na fig. 2A e indicado por uma seta preta em 2A ").

1. Encenação baseada em comprimento de metamorfose:

Em 0 hAPF, as amostras podem ser transferidos para um frasco de doceou Placa de Petri usando um pincel umedecido. Para manter as amostras de secar, adicione um pedaço de Kimwipe e umedeça com água. Frasco de transferência ou a um prato de 25 ° C até a incubadora hAPF desejado.

2. Encenação de características morfológicas visíveis:

Muitas vezes, é inconveniente para analisar amostras de CRE atividade em um ponto no tempo específico após a coleta de amostras de 0 hAPF. Alternativamente, pode-se identificar corretamente as amostras encenado em um momento conveniente para a análise com base na presença e posição de vários marcadores morfológicos (detalhada abaixo) que são visíveis através do pupário ou depois pupário remoção (Fig. 2).

2a. Critérios morfológicos para aproximar estágio metamórficas:

• 0 hAPF: White estágio prepupa onde larva pára de se mover; espiráculos anterior evertido (seta na Fig. 2A.); Laterais traquéia visível; pupário branco suave (Fig. 2A).
• ~ 14 hAPF:Pupário bronzeada e endurecido; cabeça saco evertido; traquéia lateral e gônadas menos distintas; pernas e asas totalmente estendidos ao longo do abdômen; túbulos de Malpighi ainda não é proeminente e verde (tracejada região encaixotado na figura 2B.); Olhos são unpigmented (Fig. 2B) .
• ~ 25 hAPF: Dois paralelos túbulos de Malpighi de destaque e de cor verde (tracejada região encaixotado na Figura 2C.).
• ~ 40 hAPF: corpo verde escuro amarelo posicionado entre as extremidades anterior dos túbulos de Malpighi (seta vermelha na Figura 2D.).
• ~ 50 hAPF: corpo amarelo posicionado no ponto médio dos túbulos de Malpighi (. Região encaixotado na Fig. 2E e ampliado em''2E) e os olhos são âmbar na cor, se do tipo selvagem para o gene branco (necessário para a cor dos olhos vermelhos) . Cor dos olhos está faltando nesta fase, quando o fenótipo branco mutante é resgatado pelo gene mini-branco que faz parte do transgene integrado repórter vetor (Fig. 2E).
• ~ 70 hAPF:; (. região encaixotado na Fig. 2F encaixotado e ampliado em 2F'') microchaetae torácica dorsais e macrochaetae visível (Fig. 2F, seta) corpo amarelo posicionado no posterior dos túbulos de Malpighi; cor dos olhos é pálido rosa quando resgatados pelo gene mini-branca (Fig. 2F).
• ~ 80 hAPF: pontas de asa cinza; túbulos de Malpighi localizados entre anterior ao ponto médio do abdômen (. Região encaixotado na Fig. 2G e alargada em 2G "); dobras entre os segmentos abdominais e cerdas na tergitos abdominal são visíveis (Fig. 2G e 2G "), e resgatou a cor dos olhos é vermelho brilhante (Fig. 2G).
• ~ 90 hAPF: Wings escura para preto; túbulos de Malpighi e corpo amarelo obscurecida por curtimento de tergitos; torácica (seta) e abdominal cerdas são maduros e escurecida (Fig. 2H) e mecônio verde aparece na ponta dorsal posterior do abdômen ( fig. 2H'').

Notas:

1. Em late etapas da metamorfose, o sexo dos espécimes pode ser determinada pela morfologia genital (setas na fig. 2I e 2J) ou a presença de escuro sexo pentes no primeiro conjunto de pés masculinos.
2. Maior precisão no estadiamento pode ser alcançado através de uma análise adicional de marcadores morfológicos, como descrito anteriormente ^17.

D. Passos para remover amostras de pupário:

1. Com fita laboratório aderir um pedaço de fita adesiva a uma placa de dissecção com a superfície adesiva virado para cima.
2. Wet um pincel e aplique a umidade espécimes pupariated. Usando um pincel, transferir amostras para um Kimwipe.
3. Utilizando uma pinça ou um pincel espécimes, transferência para a fita de embalagem e aderir com a superfície dorsal voltada para cima (lado curvo do pupário).
4. Deixe as amostras para secar por cerca de 15 minutos. Pupário seca são muito mais fáceis de abrir do que aqueles que são úmidos. Neste ponto, as amostras podem ser grosseiramente encenado por morfológicasmarcadores visível através do pupário.
5. Utilizando uma pinça, uma abertura progressiva do início pupário no opérculo anterior e vá até à extremidade posterior. Se uma dissecção mais fina escala é necessário para isolar um determinado tecido que pode ser feito em um vidro de relógio com solução PBS. Caso contrário, a transferência de pupas de uma gota de óleo viscoso Halocarbon HC700 (Sigma-Aldrich) em uma lâmina de microscópio.
6. Situar espécimes em um slide, usando um microscópio estereoscópico, e usando os critérios acima descritos (seção 2) fase de uma amostra pode ser determinado ..

3. Avaliação microscópica Confocal de expressão do gene repórter em uma amostra de montar toda

1. Para amostras de toda montagem, use um dos objectivos 4X ou 10X. Utilizando fluorescência estimulada pela exposição ao mercúrio da lâmpada, ou, alternativamente, através da visualização em campo claro, ajustar o estágio do microscópio de amostras posição no campo da óptica, em seguida, trazer espécime em foco.
2. Usando o microsco confocalpe software, ajustar o comprimento de onda de excitação para EGFP (ou comprimento de onda adequado ao usar outra proteína fluorescente).
3. Para evitar fotobranqueamento um espécime, começar com uma intensidade do laser de 5-10%. Se o sinal é underwhelming, em seguida, aumentar a intensidade, conforme necessário.
4. , A fim de melhorar a relação sinal-ruído para imagens confocal, ativar as configurações de software que a média medições de pixel de scans replicar, tais como média ou linha de Kalman e média pilha. Em nossa experiência Kalman média por três scans melhora a relação sinal-ruído, sem fazer o tempo para a coleta de imagem muito longo.
5. Para comparações quantitativas da atividade CRE é essencial que a intensidade de fluorescência de uma amostra não saturou muitos pixels. Usando um z-seção onde aparece fluorescência mais intensa, ajuste as configurações de modo que alguns pixels estão saturados. Isto pode ser feito mudando para uma tabela de pesquisa de saturação de alerta e ajustar a tensão do canal, ganho e offsetpara locais onde alguns pixels estão saturados. Por último, a fim de coletar sinal suficiente partir de uma amostra é muitas vezes necessário para ajustar a abertura confocal.
6. Uma vez que as configurações ideais são determinadas, execute o z-scan.
7. Quando a verificação for concluída converter a imagem em uma pilha de projeção e salvar esta imagem no Tagged Image File Format, ou "TIFF".

Nota:

1. É essencial usar as mesmas configurações confocal para todos os espécimes replicar e linhas transgene repórter que serão incluídos em uma comparação quantitativa das atividades CRE.

4. Quantificar cis-regulatórias atividade elemento

Enquanto alguns software de aquisição confocal permite para posterior processamento de imagens de projeção, nós preferimos usar o programa disponível gratuitamente Imagem software J para avaliar imagens confocal ^18. Usando Imagem J ¹⁸ padrões de expressão gravado GFPpode ser quantificado como estatísticas valor de pixel dentro de uma área especificada. Embora as imagens não precisam estar em escala de cinza, preferimos fazê-lo.

1. Com o programa Image J começou, abrir uma imagem TIFF a ser avaliada.
2. Clique no botão de seleção à mão livre e delinear a área da amostra, onde a quantificação é desejada, como por exemplo a região na Figura 3 dentro da borda tracejada amarela. (Ver nota abaixo uma relação à seleção de uma área para quantificar.)
3. Para obter uma estatística valor de pixel, clique na guia Analisar e em seguida, selecione medida. Uma caixa de resultados aparecerá mostrando a área, e as pontuações valor médio, mínimo e máximo pixel. Registrar a pontuação valor médio de pixel e repita para gerar estatísticas valor de pixel para espécimes replicar (ver nota b em relação ao número replicar).
4. Recomendamos recolher um valor de pixel segundo significa a partir de uma região de controle onde o CRE não está ativo, como por exemplo a região na Figura 3 dentro do limite tracejado a vermelho. Este último value pode ser subtraído o valor antigo para remover efeitos de fundo a partir da medição para obter um valor de pixel média ajustada. Em nossa experiência isso reduz ainda mais a variação entre os espécimes replicar (ver nota C em relação à seleção de tamanho para região de controle).
5. Use os valores de pixel ajustado significa replicar a partir de amostras para calcular a atividade média de regulamentação de um CRE eo erro padrão da média. Este valor actividade de regulação e de medição de erro pode ser comparado a outro repórter transgenes em que a seqüência CRE é diferente (por exemplo, a Figura 3).

Notas:

1. J imagem permite que o usuário selecione uma forma definida e área a partir da qual uma pontuação média pixel será determinado. No entanto, como tamanho da amostra varia frequentemente nós preferimos usar a ferramenta de seleção à mão livre para especificar a área a ser avaliada para cada espécime.
2. Um número maior de repetições (N) resulta em uma melhor estimativa do regu significaregulamentar a atividade para um dado CRE. Nós achamos que uma N entre 4 e 8 geralmente é suficiente.
3. Em nossa experiência, o tamanho da área de controle selecionado tem pouco efeito sobre o valor medido significa pixel para a região de controle. Em geral, nós selecionamos uma área proporcional em tamanho para a área de interesse.

5. Resultados representativos:

Uma versão tipo selvagem de um D. melanogaster CRE, o chamado Elemento dimórfico ^13, dirige um alto nível de expressão repórter EGFP no segmento A6 abdominal da fêmea pupas (Fig. 3A). A 13 de seqüência de pares de bases dentro deste elemento foi encontrado para ser um sítio de ligação para o fator de transcrição DSX, ea importância vivo desta seqüência pode ser demonstrado pela quantificação da atividade regulatória para este CRE quando esse sítio de ligação é mutante. Considerando a atividade regulatória do Elemento de tipo selvagem dimórfico a ser de 100 ± 5%, a mutação deste site DSX reduziu o regatividade normativas a 28 ± 3%. Comparações semelhantes podem ser feitas das actividades de regulamentação para alelos intraespecífica CRE ou entre CREs ortólogos de espécies distintas. Por exemplo, considerando os níveis de EGFP na A6 segmento feminino conduzido pelo D. tensão melanogaster Canton S como uma atividade regulatória de 100 ± 4%, CREs ortólogos para a espécie D. simulans e D. willistoni foram encontrados, respectivamente, possuem atividades regulatórias igual a 75 ± 4% e 0 ± 0% (Fig. 3B).

Figura 1. Usando a intensidade do fenótipo olho resgate branco para fazer linhagens transgênicas homozigotas. , A fim de avaliar quantitativamente transgenes repórter é importante que cada espécime tem o genótipo transgene mesmo repórter. (A) Um branco gene mutante de fundo genético com uma seqüência de local de pouso attP é utilizada para site-s ESPECÍFICOS integração do transgene. Indivíduos transgênicos (B) hemizigotos e (C) homozigotos para o vetor integrado pode geralmente ser distinguidas pela intensidade do fenótipo resgatados cor dos olhos pelo número de cópias do gene mini-integrado branco. Linhas homozigoto pode ser estabelecida através do cruzamento (C) machos e das fêmeas com o fenótipo mais escuro cor dos olhos.

Figura 2. Usando marcadores morfológicos para determinar a fase metamórfica de Drosophila. Durante a metamorfose de uma larva para um adulto mosca da fruta, as transições de amostra através de uma série de morfologias estereotipados que podem ser usados ​​para determinar o sexo ea fase aproximada de desenvolvimento. Espécimes em BH foram removidos de suas pupário. Caixas em painéis A, E, F, G e H indicam o zoom em regiões, respectivamente para os painéis A ", E", F ", G", e H ".

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Figura 3. Comparação quantitativa das atividades regulatórias cis-elemento. Para todas as amostras EGFP-repórter expressão gênica mediada por um elemento particular dimórfico foi avaliada em fêmeas em 80 horas após a formação pupário. O número no topo de cada imagem é o nível de EGFP-expressão para o espécime que é calculado como o valor de pixel significa para o segmento abdominal A6 (indicado para a imagem mais à esquerda superior como a região dentro da borda tracejada amarela) menos a média valor de pixel para o segmento A4 (correção de fundo; indicado para a imagem mais à esquerda superior como a região dentro do limite tracejado a vermelho). Para cada repórter transgene quatro repetições foram avaliadas para calcular uma média segmento de valor de pixel A6. Atividade regulatória é relatado como o% do tipo (A) selvagem ou (B) estirpe Canton S feminina valor médio de pixel ± SEM. (A) expressão GFP para as mulheres que possuem um alelo tipo selvagem doElemento dimórfico e uma versão mutante, onde um único local de ligação para o fator de transcrição DSX foi cauterizado. Este site mutante vinculativo redução da atividade Elemento dimórfico a 28 ± 3% da seqüência do tipo selvagem. (B) Comparação das actividades de regulação para as sequências de ortólogos para a D. melanogaster Elemento dimórfico (estirpe Canton S). Considerando a expressão GFP mediada por um D. melanogaster alelo Elemento dimórficos como 100%, as seqüências dos ortólogos espécies relacionadas D. simulans e D. willistoni, respectivamente, possuem atividades de 75 ± 4% e 0 ± 0%.

6. Materiais

Nome do material	Tipo	Companhia	Número Catálogo	Comentário
Site-specific a integração do transgene	Serviço	Gene melhor	Plano de H	Escolher um local de pouso, receber linhas transformantes
Oil Halocarbon	Reagente	Sigma-Aldrich	H8898	Usado para montar as amostras para a imagem latente confocal
Dumont n º 5 Pinça	Ferramenta	Multa Ferramentas Ciência	11252-40	Fina e durável apontou para dissecção
SZ61 microscópio estéreo Zoom	Ferramenta	Olimpo	Personalizável	Óptica excelente para trabalhar com moscas de fruta
FluoView Microscópio Confocal	Ferramenta	Olimpo	Personalizável	Fornece imagens de alta resolução confocal

Discussão

cis-regulatórias elementos codificar o programa de genômica que especifica padrões de expressão gênica e, assim, o processo de desenvolvimento ^1, e são locais importantes para ambas as mutações subjacentes evolução morfológica ^2-4 e variação fenotípica de traços humanos ^5,6,19. Apesar desta importância, a lógica regulamentar para CREs continuam a ser mal compreendido. Uma razão importante para a compreensão desse déficit tem sido a falta de métodos adequados...