המחברים מבקשים להודות למלינדה Hexum לייזום של פרוטוקול EB הספין במעבדה שלנו. ברצוננו להודות לחברים אחרים במעבדה, כולל לורה א Bendzick, מייקל Lepley, וז&#39;ניה Ni לקבלת הסיוע הטכני שלהם עם העבודה הזאת. המחברים גם רוצים להודות לבראד טיילור בCaliper מדעי חיים לעצת המומחה הטכני שלו.

1. התאמת hESCs או iPSCs בTrypLE לתרבויות EB ספין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניתוק הראשוני עם TrypLE עובד הכי טוב אם מושבות ES / IPS מתרבויות collagenase-passaged הן קטנות יחסית. ES מתחיל / אוכלוסיות iPS צריכים להיות תאים עבר לא יותר מ 4-5 ימים קודמים. 4-5 ימים לפני תחילתו של מעב...

<ol>
	<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).</li><li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).</li><li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+clinical+therapies+using+hematopoietic+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Blood. 114, 3513-3523 (2009).</li><li>Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+describing+the+use+of+a+recombinant+protein-based,+animal+product-free+medium+(APEL)+for+human+embryonic+stem+cell+differentiation+as+spin+embryoid+bodies.">A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies.</a> Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li><li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34++cells:+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential.">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105, 617-626 (2005).</li><li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+differentiate+into+a+homogeneous+population+of+natural+killer+cells+with+potent+in+vivo+antitumor+activity.">Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity.</a> Blood. 113, 6094-6101 (2009).</li><li>Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+NK+cells+acquire+functional+receptors+and+cytolytic+activity.">Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity.</a> Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).</li><li>Ni, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cells+Produce+Natural+Killer+Cells+That+Mediate+Anti-HIV-1+Activity+by+Utilizing+Diverse+Cellular+Mechanisms.">Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms.</a> Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+spin+embryoid+bodies+and+a+description+of+the+hematopoietic+blast+colony+forming+assay.">Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).</li><li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+IL-21+Promotes+Sustained+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells.">Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells.</a> PLoS ONE. 7, e30264 (2012).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+Purification,+and+Functional+Assessment+of+Human+Peripheral+Blood+NK+Cells.">Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells.</a> J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+imaging+demonstrates+that+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+CD34++cells+preferentially+develop+into+endothelial+cells.">Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells.</a> Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).</li><li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+transposon-mediated+gene+transfer.">Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer.</a> Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+fluorescent+proteins.">Near-infrared fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7, 827-829 (2010).</li><li>Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+luminescence+assays+using+scintillation+counters+for+quantitation+in+transfected+mammalian+cells.">Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging.">Bioluminescence Imaging.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).</li><li>Santos, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+in+vivo+imaging+of+T+cells+using+a+membrane-bound+Gaussia+princeps+luciferase.">Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase.</a> Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+Their+Applications+in+Imaging+Living+Cells+and+Tissues.">Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues.</a> Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Lymphocytes+to+Study+In+Vivo+Trafficking+and+Immunotherapy.">Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy.</a> Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System.">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li></ol>

hESCs הוא פלטפורמה אידיאלית ללמוד סוגי תאים שונים ולהחזיק פוטנציאל יוצא דופן לתרגום קליני. אנו משתמשים, גישת EB ספין מוגדר להבדיל hESC / iPSCs לתאי אבות היווצרות דם. גישת EB הספין הניבה גזירה של תאים והתמיינות לתאי NK hematopoietic עולה בקנה אחד, ובכל זאת, עדיין קיימת שונות ביעילות ביד...

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) הם תאים בלתי מפותחים, pluripotent מסוגלים בידול התחדשות עצמית ורבת שושלת בלתי מוגבל. hESCs כבר הבדיל בהצלחה לקבוצות משנה בוגרת ותפקודיות של כל שכבת נבט, כוללים תאים של מערכת hematopoietic 1-3. טבעיים (נ&quot;ח) רוצח תאים לימפוציטים של מערכת החיסון המולדת שניתן להפיק מhESCs על ידי היווצרות של גופי embryoid (EBS) 4,5 או תרבות משותפת עם שורות תאי סטרומה 1,2,6-8. תאי NK יש יכולות אנטי ויראלית ואנטי סרטנית ויש לו את הפוטנציאל להיות יעיל נגד טווח רחב של גידולים ממאירים, כפי שהם אינם דורשים גירוי אנטיגן לפני לבצע פעולות מפעיל שלהם. לכן, תאי NK hESC הנגזרות הם מקור אטרקטיבי של תאים לטיפול חיסוני. בנוסף, הנטילה של תאי NK מhESCs מספקת מערכת גנטית נוחה ללמוד התפתחות נורמלית &lt;em&gt; במבחנה. משום שהם מספקים מערכת גנטית צייתנית, תאי NK hESC הנגזרות יכולים להיות שונה באופן ניסיוני להביע כתבי ניאון וbioluminescent מתן מודל אופטימלי ללמוד פונקציות מפעיל NK תאים במבחנה ובחי. תאי NK hESC הנגזרות בעלי פעילות נגד מגוון רחב של יעדים, כולל 9 HIV, לוקמיה (K562) וסוגי סרטן אחרים 7,8. עם זאת, היכולת להפיק יעילות מספיק תאי NK המסוגלים חולי טיפול נשאר מכשול חשוב לתרגום קליני, והוא, במידה פחותה, להגבלה נרחבת טרום קלינית במחקרי vivo של התפתחות תא NK ופונקציות אנטי סרטניים. כאן, אנו משתמשים בגישת EB ספין לגזור אבות hematopoietic מhESCs 4,5,10. לאחר 11 ימי הספין EBS מועבר לתרבית תאי NK עם או בלי מתקני האכלה במשך 28 ימים. לאחר 4 שבועות במדיום תרבות תא NK, תאי NK הם טראןsferred לתרבות משותפת עם K562 תאים מהונדסים להביע אינטרלוקין קרום הנכנס 21 (IL-21), המשמש כתאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPCs). התאמת פרוטוקול להתרחבות של תאי NK דם היקפיים באמצעות אלה נגמ&quot;שים מלאכותיים 11,12, אנו מסוגלים להרחיב את תאי NK-2 יומנים תוך שמירה על הפנוטיפ בוגר ויכולות ציטוטוקסיות. תהליך זה של פיתוח והרחבה מספק תאי NK hESC הנגזרות מספיקים לרב באפיון vivo. במחקרי vivo, אנו מסוגלים לפקח engraftment וקינטיקה לטווח ארוכים של לוציפראז הגחלילית המוזרק הלא פולשני להביע (fluc +), תאי NK hESC שמקורם בשימוש בהדמית פליטת אור. יתר על כן, אנו מסוגלים לעקוב אחר אינטראקציות תא NK עם תאים סרטניים באמצעות ערכה כפולה, bioluminescent או ניאון הדמיה. מחקר קודם לכן על ידי הקבוצה שלנו בשימוש בהדמית פליטת אור מודל אנטי גידול לעקוב אחרי התקדמות גידול וCLEarance של K562 + תאי fluc in vivo 7. עכשיו, באמצעות הנדסת hESCs לבטא גחלילית לוציפראז 13,14 אנחנו יכולים לעקוב biodistribution והסחר של תאי NK לK562 תאים סרטניים המבטאים את החלבון פלואורסצנטי מתאפיין לאחרונה, turboFP650 15. אנו בחרנו מערכת כתב כפול זה על מנת לעקוב בו זמנית בשתי אוכלוסיות תאי in vivo (איור 1). מודלים הדמיה כפולים ביותר היו מערכות כפולה לוציפראז, אבל המערכות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית בשל דרישות האספקה ​​של coelenterazine, המצע נדרש לביטוי של רוב Renilla וכתבי לוציפראז Gaussia 16-18. כתבי ניאון אפשרו ניטור קל של שורות תאים רבות ובונה במבחנה, אך יש לו הצלחה מוגבלת בתחום ההדמיה vivo בשל החפיפה בין הרקמות וautofluorescence הפרווה וספקטרום הפליטה של שיתוף רביםמשמש mmonly כתבי ניאון כולל GFP, DsRed, וTdTomato 15,19. עודד חשש זה הפיתוח של חלבוני ניאון מרחיק אדומים, המאפשרים לpenetrance רקמה טובה יותר, ואות ספציפית גבוהה יותר בהשוואה לרקע 15,19. TurboFP650, חלבון פלואורסצנטי שמוצג במערכת זו, הוא מרחיקת אדומה העביר ומתגבר רבים של הבעיות מעורבות עם חלבוני ניאון הדמיה בבעלי חי חיים. שיטה זו לפיתוח והרחבת תאי NK הנגזרים מhESCs אפשרה לנו לאפיין את תאי NK hESC הנגזרות נוסף במבחנה ובחי, אשר הכרחית כדי להבין טוב יותר את תפקוד תא NK וחשיבות קלינית כדי לשפר את הטיפולים בתאי NK מאמצים הנוכחיים. זה גם נוח לגזירה וההתרחבות של תאי NK iPSC הנגזרות. ערכת ההדמיה הניאון וbioluminescent הכפולה היא החלים רחב למערכות אחרות מאשר הדגם אנטי גידול שהראינו כאן.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BPEL media for Spin EB generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3022801</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31765035</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3311</td>
			<td>Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthechol 500X solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5442</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-monothioglycerol (a-MTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5442</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-free hybridoma mix II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12040077</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NK Differentiation Media </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CX30315</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomed</td>
			<td>HP1022HI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ng/ml Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 uM ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/ml ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 uM 2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>CX30310</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Cytokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(all cytokines used fresh from frozen aliquots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>300-07</td>
			<td>40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-4</td>
			<td>R &amp;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>20 ng/ml in BPEL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhVEGF</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>20 ng/ml in BPEL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-02</td>
			<td>1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-15</td>
			<td>10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-03</td>
			<td>5 ng/ml in NK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-7</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-07</td>
			<td>20 ng/ml in NK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3-Ligand</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>300-19</td>
			<td>10 ng/ml in NK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>In vivo Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Sodium Salt</td>
			<td>Gold BioTechnology</td>
			<td>Lucna-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboFP650 plasmid</td>
			<td>Evrogen, Moscow, Russia</td>
			<td>FP731</td>
			<td>Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells</td>
			<td>MD Anderson, Houston, TX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>contact: Dean A. Lee. <a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank">http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferase expressing hESCs</td>
			<td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboFP650 expressing K562 cells</td>
			<td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

development, expansion, and in vivo monitoring of human nk cells from human embryonic stem cells (hescs) and induced pluripotent stem cells (ipscs)

אנו מציגים שיטה להפקה טבעי (נ&quot;ח) רוצח תאים מhESCs מובחן וiPSCs באמצעות גישה חופשית מזין. שיטה זו מביאה לרמות גבוהות של תאי NK לאחר שבועות תרבות 4 ויכולה לעבור התרחבות של 2 יומן נוסף עם תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים. hESC וiPSC נגזר תאי NK התפתחו במערכת זו יש לי הפנוטיפ ותפקוד בוגר. הייצור של כמויות גדולות של תאי NK גנטי לשינוי הוא ישים עבור שניהם מכניסטית בסיסית, כמו גם מחקרים אנטי סרטניים. ביטוי של לוציפראז הגחלילית בhESC שמקורם בתאי NK מאפשר גישה לא פולשנית לעקוב engraftment NK תא, הפצה, ותפקוד. אנו גם מתארים הדמיה כפולה ערכה המאפשרת ניטור נפרד משתי אוכלוסיות תאים שונות כדי לאפיין את יחסי הגומלין שלהם יותר במובהק in vivo. שיטה זו של גזירה, הרחבה, וכפול in vivo ההדמיה מספקת גישה אמינה לייצור תאי NK וevaluation אשר הכרחי כדי לשפר את הטיפולים בתאי NK מאמצים הנוכחיים.

הדור של תאי hematopoietic המשתמשים בגישת EB הספין מאפשר פיתוח תא NK אופטימלי מhESCs וiPSCs. כפי שמודגם באיור 2, 11 יום הספין EBS מכיל אחוזים גבוהים של תאים המבטאים CD34, CD45, CD43, וCD31. רמות גבוהות של CD34 ו CD45 מאפשרת העברה ישירה לתנאי NK ללא צורך במיון או לתמיכה בתאי סטרומה. אם יש בידול ...

Watch this Scientific Journal Video about Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs at JoVE.com

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח, הרחבה, ובתחום ההדמיה vivo של תאי NK הנגזרים מhESCs וiPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)