マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

要約

このレポートでは、短い持続軽麻酔下マウスにおける腰椎脊髄におけるsiRNAのローカライズされたトランスフェクションのための髄腔内針穿刺の簡便かつ迅速な技術が記載されている。

要約

このレポートでは、カテーテル注入のすなわち独立した非侵襲的な方法で、急性くも膜下針注射技術に関するステップバイステップガイドを、説明しています。この手術法の技術的な制限は、手のフィネスにある。注射は、特に訓練された実験のために、迅速であり、この技術では、組織破壊が最小であるので、反復注射が可能であり、外来ツールにさらに免疫反応が起こらず、それによってより良く読み出すより具体的に与えること（ 例えばカテーテル）。脊髄変調の。物質の適用は、主として脊髄の標的領域に制限されるので^、薬物は、大用量で適用する必要はなく、他の組織でのより重要なのは望ましくない効果は、全身送達で観察されるように^、1を回避することができる^2。また、我々はpolyethylenimの助けを借りて、核酸のin vivoトランスフェクションで、この手法を組み合わせるINE（PEI）の薬理学的薬剤の配信だけでなく、遺伝子、RNA、およびタンパク質モジュレーターを経由して 、脊椎の機能を研究するための多大な汎用性を提供し、試薬^3、。

概要

脊髄は加工や痛みを伴う（侵害受容性）の入力^4-7の送信を含む主要な生物学的プロセスおよび生理的機能の様々な非常に重要な中心地です。様々な実験技術は、髄腔内カテーテル^8、脊髄マイクロインジェクション、および髄腔内注射針⁹の慢性的注入として、脊髄の薬理学的調節を容易にするために開発されてきた。それぞれの手法には独自の利点と欠点があり、実験パラダイムによっては一つの技術は、他よりも適しているかもしれません。髄内へのカテーテルの慢性的注入はラットにおいて容易に実現可能であるのに対して、この方法は、サイズの制限が指定され、マウスでは非常に困難である。成功率は非常に低く、運動障害は、しばしば、マウスにおいて厳しく限定さ硬膜下腔カテーテルのかさばる存在に起こる。また、薬の長期的な配信が頻繁な血液凝固にレ​​ンダリングされる慢性的に注入されたカテーテルの。最後に、免疫反応が一般的です。

これらの問題は、マウスの脊髄への薬物および試薬の迅速かつ解剖学的に制限されたアプリケーションを可能にしますpreimplantedカテーテルの非存在下で針を介して急性髄腔内注射の方法を使用して回避することができる。この方法は、完全に脊椎低減投与量および制限副作用を可能にする調節、ならびに物質がない送達する能力の特異性のような他の全身送達経路（ 例えば 、経口、静脈内、腹腔内等 ）上の髄腔内送達の利点を保持する髄腔内注射の間、針が硬膜と脊髄の間に挿入されているため、通常は血液脳関門を通過しない。しかしながら重要なことには、髄腔内送達の他の方法と比較して、髄腔内注射針注入法では、多数のアプリケーションを可能にする、最小侵襲性で任意のかなりの組織損傷を引き起こしたり、異物の移植による免疫反応を惹起せずに同じ動物。ただし、有効性を可能にするために、針の非​​常に正確な標的化のための技術的なスキルが必要です。

ここでは、視覚的に具体的に腰部脊髄を標的化するための最適な成功率を達成するための方法を示す。この実験で選択される注射部位は、脊髄脊椎を損傷する可能性を最小限にするために、終了に近いところ、L5およびL6脊椎動物列間の溝である。また、我々は、siRNAを用いた脊髄中の遺伝子をノックダウンするために、この技術の使用を示す。

プロトコル

すべての動物に使用する手順は、ローカルの管理組織（Regierungspräsidiumカールスルーエ、カールスルーエ、ドイツ）が定める倫理指針に従った。

1。のsiRNA / PEI複合体の調製

以下のようなsiRNA / PEI複合体溶液を製造業者の指示を用いて調製される。

1. 溶液A：端体積の四分の一までの無菌水を有するsiRNAの所望の量（必要な場合）で希釈し、端体積の半分まで10％グルコース溶液を上にして、さらにこれを希釈する。ボルテックス優しく上下にピペッティングにより混和する。 siRNAの最適量は、経験的に決定される必要があるが、動物あたり10μlの複合体溶液中の1μgのsiRNAは、最適化のための良い出発点である。
2. 溶液B：エンドボリュームの4分の1に滅菌水を上にして、PEI試薬の必要な量を希釈し、最終体積の半分、10％グルコース溶液を上にしてこれをさらに希釈する。渦GEntlyまたは上下にピペッティングにより混和する。
   注意：PEI試薬の量は、トランスフェクションの効率に影響の複合体中のイオンバランスを決定します。同様に、PEI溶液の最適量は、経験的に決定されなければならない。私たちの手では、最適量は1μgのsiRNAのあたりのPEI溶液を0.12μLです。
3. 溶液Bと溶液Aを混合一斉に、穏やかにボルテックス。
4. 使用前にRTで15分間混合液をインキュベートする。この複合体は、4℃でRTで2時間および24時間安定である

2。髄膜注射

1. それが正向反射の兆候を示していないまで、3％イソフルランでマウスを麻酔。加えて、さらなる麻酔の状態を確実にするために、テールおよび/または足のピンチレフをチェック。
2. 針挿入時に良好な視覚化を容易にするために、尾の付け根付近の動物の後方端部に毛皮の約2 cm ^2とを剃る。
3. マウスを所定の位置に手順の間に継​​続的なイソフルランの投与のためのノーズコーン、1.5％イソフルランを削減し、目の潤滑剤で、マウスの目をカバーしています。
4. 針に30のG 0.5に添付25μlのハミルトンシリンジを使用したsiRNAの混合溶液を使用する準備が準備します。
5. 最も顕著な1であること、静かにそれを押すことで、この領域を中心に、脊椎動物の列を修正する必要のある、L6の棘突起の位置を確認します。
6. 慎重にL5およびL6椎骨の溝との間に針を挿入し、このサインが硬膜内空間での針の成功エントリを示すのでテールフリックを観察。
   ヒント：指の爪を使用して、1が同様に溝を見つけることができるはずです。
7. テイルフリックが観察されたら、すぐに、しかし慎重に、一方の手で針位置を固定し、他方をゆっくりと物質の所望量を注入する。
   ヒント：5〜10μlの間のボリュームがボリュームとして最適である5未満＆＃181、Lは信頼性が低く、10μLよりも大きなボリュームがあまりにも多くの圧力につながる。
8. 噴射が行われた後、麻酔から回復するためにケージに戻ってマウスを移動します。
9. 標的遺伝子の最適なダウンレギュレーションを達成するために、この注射を少なくとも2回以上24時間毎に繰り返します。

結果

成功した注入を例証するために、我々は成体のC57Bl6マウス（8〜10週齢）にファストグリーンFCF染料を使用してこの手法を行った。動物は、染料が拡散し、次いでCO ₂過剰投与により殺しするのに十分な時間を提供するために、注入後数分間回復させた。その後、脊椎動物の列には、解剖し脊髄を露出させた。拡散色素に対応する青色の斑点は、注射部位をマーク。脊髄への損傷の兆候?...

ディスカッション

従って、髄腔内注射針の上記の技術は、有効な高速、特異的に局在し、かつ非破壊的である。技術的には、この手順の最も重要な側面は、溝に針の挿入のポイントです。それは、この手順は非常に穏やかに手と忍耐で行われていることが重要です。多くの外科的処置と同様に、トレーニングが成功した注入速度を向上させます。実際の実験中に、この手法は、直接注射が成功したか否かを確?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
In Vivo-jetPEI	Polyplus	201-10G
WAVE1 siRNA	Santa Cruz	sc-36832
Control siRNA-A	Santa Cruz	sc-37007
Anti-ß-Tubulin III antibody	Sigma	T2200
Anti-WAVE1 antibody	R&D Systems	AF5514
Fast green dye	Sigma	F-7252
Isoflurane	Baxter
Isoflurane setup	Dräger Lübeck
Shaver	Wella
Hamilton syringe Gastight 1702	Hamilton
30 G 1/2 in 13 mm Needle	BD Microlance	304000
Microscope Leica MS5	Leica
WAVE1 forward primer for qRT-PCR	Sigma		cacagagcctcaggacagg
WAVE1 reversed primer for qRT-PCR	Sigma		cttttcaccaacggcatctt
FastStart Essential DNA Green Master	Roche	6402712001