O uso do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler Circuito Aparelho para avaliar a biocompatibilidade de Modificados Condutas sangue Poliméricos

Resumo

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Resumo

A reacção de corpo estranho ocorre quando uma superfície sintética é introduzida no corpo. Caracteriza-se por adsorção de proteínas do sangue e a subsequente ligação e activação de plaquetas, monócitos / macrófagos de adesão, e os eventos de sinalização celular inflamatório, levando a complicações pós-procedimento. O Aparelho Chandler laço é um sistema experimental que permite aos investigadores a estudar as interacções celulares e moleculares que ocorrem quando grandes volumes de sangue são perfundidos sobre condutas poliméricos. Para esse efeito, o aparelho tem sido utilizado como um modelo ex vivo, permitindo que a avaliação das propriedades anti-inflamatórias de várias modificações da superfície do polímero. Nosso laboratório mostrou que condutas de sangue, covalentemente modificadas via química fotoativação com CD47 recombinante, pode conferir biocompatibilidade de superfícies poliméricas. Acrescentando CD47 para superfícies poliméricas pode ser um meio eficaz para promover a eficácia das condutas de sangue poliméricos. Seuein é a metodologia que detalha a química fotoativação usado para acrescentar CD47 recombinante para condutas de sangue poliméricos clinicamente relevantes e com o uso do laço Chandler como um modelo experimental ex vivo para examinar interações sangue com a CD47 modificado e controle de condutas.

Introdução

Muitos procedimentos clínicos, tais como a circulação extracorpórea e diálise renal, requerem o uso de condutos de sangue poliméricas e são frequentemente associados com complicações pós-procedimento ^1. Quando perfundido com sangue, estes polímeros ilícito a reação de corpo estranho (FBR), resultando na adsorção de proteínas do sangue e plaquetas, a adesão de monócitos / macrófagos e liberação de citocinas pró-inflamatórias, o que contribui para complicações pós-procedimento e / ou ^2,3 falha do dispositivo. Assim, estratégias para abordar esta questão continuar a ser uma área importante e contínuo de pesquisas em biomateriais. Os pesquisadores têm tentado resolver este problema modificando sangue entrar em contato com as superfícies com bioativos ou bio-inerte moléculas ^4-6. A investigação no nosso laboratório tem-se centrado em acrescentando CD47 recombinante (recCD47) a biomateriais poliméricos como uma estratégia para mitigar o FBR e aumentar a eficácia destes materiais. CD47 é uma transmembr expressa ubiquamenteane proteína com um papel conhecido na evasão da resposta imune, conferindo status de "self" em cima de expressar as células ^7-10 e mostra a promessa de conferir biocompatibilidade quando anexado a superfícies poliméricas ^11-13. Sinal-alfa proteína reguladora (SIRPα), o receptor cognato para o CD47, e um membro do motivo inibidor de imunorreceptores baseado em tirosina (ITIM) molecular contendo família de proteínas transmembranares, é expresso em células de origem mielóide ^14. Nós já anteriormente demonstrado que a CD47, por meio de sinalização celular mediada SIRPα, sub-regula as respostas imunitárias a de poliuretano (PU) e de cloreto de polivinilo (PVC) em in vitro, ex vivo e in vivo em modelos de ^11-13.

Central de nossas investigações é uma relativamente nova química fotoactivação, aqui descrito, em que os grupos tiol reactivos quimicamente são covalentemente anexado ao tubo polimérico fazendo reagir o tubo com um polímero multifuncional (PDT-BzPh), composto de 2-piridilditio (PDT), a benzofenona fotoreactivo (BzPh) e uma polialilamina modificado por carboxi ^11-13. A redução dos grupos PDT covalentemente anexas com tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) ¹¹ produz uma superfície que pode ser tiolado subsequentemente reagido com porções terapêuticas. Aqui e anteriormente detalhada ^12,13, recCD47, adicionalmente modificado com a adição de uma cauda poli-lisina C-terminal de ^12,13, é feito reagir com sulfossuccinimidil-4-[N -maleimidomethyl] ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) durante 1 h para gerar grupos tiol-reactivo, que permite a formação da ligação entre o tubo monossulfureto e recCD47 ^11. A capacidade anti-inflamatória das superfícies funcionalizadas CD47 foi testado, ex viv o, utilizando o Aparelho de Chandler loop com sangue humano total, que foi inicialmente descrita em 1958 como um modelo in vitro da coagulação trombótica ^15. O aparelho baseia-se numasistema de tubos fechado parcialmente cheio com ar e um motor rotativo para fazer circular o sangue através da tubagem ^15. Este modelo experimental, proporciona a oportunidade de estudar o efeito da exposição a sangue sobre superfícies modificadas e não modificadas, bem como o efeito destas modificações de superfície sobre a fisiologia das células do sangue.

recCD47 pode ser anexado a uma variedade de superfícies de polímeros, utilizando química de fotoactivação este, e a sua capacidade anti-inflamatória pode ser avaliada utilizando um modelo clinicamente relevante ex vivo imitando perfusão do sangue sobre as superfícies poliméricas ^11,12. Condutas de sangue grau clínico modificados com recCD47 mostram significativamente menos de plaquetas e ligação de células inflamatórias, em comparação com os polímeros não modificados quando expostos a sangue humano no dispositivo. Uma descrição passo-a-passo do presente processo de modificação é detalhado abaixo.

Protocolo

1. Modificando poliméricos Superfícies com recCD47

NOTA:. O protocolo é resumido esquematicamente na Figura 1 A Figura 1A ilustra a geração de superfícies poliméricas tiol-reactivo Figura 1B ilustra a geração de recCD47 reactivo com tiol..

1. Dia 1
   1. Prepara-se uma solução de PDT-BzPh (1 mg / ml) e bicarbonato de potássio _(KHCO3) (0,7 mg / ml) em água estéril. Agita-se durante a noite a 4 ° C (protegido da luz).
2. Dia 2
   1. Cortar tubo polimérico em 40 centímetros de comprimento (o tempo suficiente para caber em torno de rodas rotativas).
   2. Soak tubos em uma solução aquosa a 0,1% de hexacylpyridinium durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador ou em loop Aparelho Chandler. Lavar os tubos com 3x de água estéril após a 90 min de molho.
   3. Acidifica-se a solução de PDT-BzPh do Dia 1 por adição de 15% de potássio monobásico aquoso (KH ₂ PO _4). Adicionar 50 ul _de KH ₂ PO ₄ por ml de PDT-BzPh, formando uma solução micelar turvo.
   4. Embeber os tubos na solução PDT-BzPh acidificada durante 40 minutos à temperatura ambiente num agitador ou no aparelho.
   5. Lavar os tubos com ácido acético diluído (1: 1000), uma vez.
   6. Expor os tubos a irradiação UV durante um período total de 60 minutos. Gire tubos de ¼ de volta a cada 15 min para irradiar toda a superfície.
   7. Embeber os tubos com uma solução de 20 mg / ml de bicarbonato de potássio _(KHCO3), durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador ou no aparelho.
   8. Lavar os tubos com 3x de água estéril e armazenar a 4 ° C em água estéril.
3. Dia 3
   1. Dissolver 5 mg Sulfo- SMCC em 200 mL dimetilformamida (DMF) (Atenção: Realize em hotte).
   2. Adicionar 50 ul da solução de Sulfo-SMCC, preparado no passo 1 a 0,1 mg / ml de solução de poli-lisina recCD47, e agita-se durante 60 min a rotemperatura om.
   3. Durante 60 min de agitação, degas estéril Tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) e reserve.
   4. Purificar Sulfo- SMCC reagiu recCD47 usando um corte de coluna de dessalinização rotação 7K peso molecular por instruções do fabricante. Recolha de escoamento final (de alta qualidade tiol-reactivo recCD47) e diluir até ao volume necessário para revestir o interior do tubo com DPBS.
   5. Lavar os tubos a partir do dia 2 com estéril, desgaseificadas DPBS 3x.
   6. Reagir a superfície modificada dos tubos com uma solução de 20 mg / ml com tampão de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) em DPBS desgaseificados durante menos de 2 minutos. Lavar os tubos com estéril desgaseificadas DPBS 4x.
   7. Adicionar o recCD47 Sulfo-SMCC-reagido para os tubos e incubar durante a noite a 4 ° C num agitador ou em aparelhos.

2 Imuno Quantificação de recCD47 em Superfícies Modificadas

1. Lavar tubos adaptados para ser quantificado a partir do dia 3 sagacidadeh DPBS 3x. Tubos loja não utilizado para a quantificação em DPBS a 4 ° C.
2. Use uma biópsia por punção de 4 mm a fazer duplicados de amostras de tubo e colocar punções em poços de uma placa de 96 poços.
3. Preparar um controle negativo constituído por um tubo de amostra não modificada não tratados com o anticorpo de detecção. Preparar um anticorpo de controlo que consiste de um tubo de amostra não modificada tratados com o anticorpo de detecção. Preparar as amostras para ensaio de tubagem modificados tratados com o anticorpo de detecção.
4. Amostras do bloco com 0,4% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS durante 60 minutos à temperatura ambiente num agitador.
5. Após o bloqueio, aspirado BSA e enxágüe com Tris salina acrescida de 1% (TBST) 3x-20 Tween, 10 min cada um em uma coqueteleira.
6. Prepara-se uma diluição de trabalho de anticorpo em 0,4% de BSA de acordo com a diluição recomendada pelo fabricante para os imunoensaios. Diluir anticorpo CD47 humano B6H12-FITC a 1: 100 em 0,4% de BSA.
7. Adicionar 200 ul da diluição do anticorpo aos poços apropriados. Incubacontrolos negativos te com 0,4% de BSA. Incubar à temperatura ambiente durante 60 min, num agitador (proteger da luz).
8. Enxaguar com TBST 3x, 10 min cada um em uma coqueteleira. Aspirar o último enxágüe TBST e adicionar 200 DPBS ul para poços de amostra do tubo.
9. Recolhe-se o fluxo de passagem final, que é de alta qualidade tiol reactivos CD47 recombinante e diluir até ao volume necessário para revestir o interior dos tubos com DPBS.
10. Leia intensidade do sinal FITC utilizando um leitor de microplacas com FITC excitação (485 nm) e emissão (538 nm) configurações.
11. Calcular recCD47 ligado à superfície polimérica com base em valores de referência, correspondendo a autofluorescência e ligação não específica a partir da amostra de controlo sem anticorpo.

3. Chandler Circuito Aparelho Protocolo

Procure Institutional Review Board (IRB) aprovação do protocolo de coleta de sangue e informado consentimento papelada antes do início da recolha de amostras de sangue humano. Obter informaçõesconfirmada através consentimento de um doador de sangue humano.
NOTA: Um diagrama que representa o aparelho é mostrado na Figura 2.

1. Encha banho de água com água destilada até aproximadamente 1/2 do diâmetro das rodas estão submersas. Adicionar branqueador suficiente para o banho de água para fazer uma solução de lixívia a 10%. Definir banho de água a 37 ° C e deixar equilibrar à temperatura.
2. Reunir placas de metal (mostrados na Figura 1B), tubos não modificada e modificada tubagem, e montar em torno de rodas de aparelhos, como mostrado na Figura 1C. Certifique-se de que os tubos se encaixa confortavelmente em torno da roda com a placa de metal no local.
3. Obter 30 ml de amostra de sangue utilizando um protocolo IRB-aprovado, em um frasco pré-cheio com 2 ml de citrato ou outro anticoagulante, e misturar por inversão para evitar a coagulação, uma vez que a amostra tenha sido recolhida.
4. Adicionar cerca de 10 ml de sangue para cada tubo, utilizando a válvula e uma seringa de metal, deixando um pouco de ar no tubo. Fixe a tampa da válvula e rotate durante 3 horas.
5. Drenar o sangue em um copo de resíduos tratados com uma solução de água sanitária a 10% (ou conforme exigido pela política institucional).
6. Gentilmente lavar interior tubulação com DPBS para remover todos os vestígios de sangue. Recolha de escoamento no copo de resíduos. Descarte de sangue em conformidade com a política institucional.
7. Desinfectar o aparelho e qualquer contato com sangue superfícies usando uma solução de água sanitária a 10% ou de acordo com a política institucional.
8. Amostras de processo para a microscopia eletrônica de varredura ou microscópio fluorescente, conforme descrito abaixo.

4. Microscopia fluorescente e contando celular

1. Prepare uma solução de paraformaldeído 4% (PFA) (Atenção: Realize em hotte).
2. Incubar tubagem numa solução PFA a 4% durante a noite a 4 ° C.
3. Após incubação durante a noite, retire PFA 4% e enxaguar filmes muito suavemente com DPBS.
4. Corte o tubo em seções para expor a superfície do lúmen para a coloração.
5. Stainuma secção do tubo com algumas gotas de meios de montagem com o 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), durante 30 min à temperatura ambiente (proteger da luz). Após a coloração, lavar a tubulação muito suavemente com DPBS para reduzir o sinal DAPI fundo.
6. Imagem usando um microscópio de fluorescência equipado com um filtro de DAPI e câmara digital para contar o número de células em 9 campos cegamente seleccionados de vista sob uma ampliação de 200X.
7. Célula registro contagens por campo de visão e realizar análises estatísticas apropriadas para determinar a significância estatística dos resultados.

5. Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Prepare uma solução de glutaraldeído 2% (Atenção: Realize em hotte).
2. Incubar tubagem numa solução de glutaraldeído a 2% durante a noite a 4 ° C.
3. Após incubação durante a noite, lavar cuidadosamente o tubo de 3x com DPBS.
4. Prepare uma solução de 1% de tetróxido de ósmio (Cuidado: perigo de inalação grave! Use em hotte).
5. Incubar a tubagem para uma solução a 1% de tetróxido de ósmio durante 15 minutos à temperatura ambiente.
6. Lave o tubo de 3x com DPBS.
7. Prepara-se uma série de concentrações de etanol (25%, 50%, 75%, 95%, e 100% de etanol).
8. Desidratar a tubagem por incubação em série de concentrações de etanol. Incubar em 25%, 50%, 75%, e etanol a 95% durante 20 min cada. Incubar em etanol a 100% durante 30 min.
9. Ponto supercrítico secar a tubulação com CO ₂ por 45 min para remover toda a umidade.
10. Secções tubulares montar em um esboço espécime com pasta de prata ou grafite.
11. Secções tubulares de revestimento com 12,5 nm de ouro-paládio.
12. Analisar em um microscópio eletrônico de varredura.

Resultados

Gerando superfícies poliméricas tiol-reactivo por meio do uso de PDT-BzPh e TCEP juntamente com tiol-reactivo recCD47 poli-lisina usando SMCC permite a fixação de recCD47 a superfícies poliméricas. O processo de modificação é resumida esquematicamente na Figura 1. A conveniência deste processo de modificação é que ele pode ser aplicado a muitas proteínas diferentes e as diversas superfícies poliméricas diferentes, assumindo que a proteína pode ser modificado com grupos quimicamente reac...

Discussão

A química fotoativação (resumidos na Figura 1) permite a modificação de praticamente qualquer superfície de polímero que tem hidrocarbonetos suficientes para facilitar PDT-BzPh apego e irradiação UV subseqüente ao photo-ativar o PDT-BzPh. Funcionalização da superfície polimérica com grupos tiol reactivos permite a subsequente ligação de uma série de moléculas de interesse testáveis. Em nossos estudos específicos que escolhemos recombinante CD47 ^11-13. A conjugação quími...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891