L&#39;uso della<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler Loop Apparecchio per valutare la biocompatibilità di Modificati Condotti sangue Polimerici

Riepilogo

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Abstract

La reazione corpo estraneo si verifica quando una superficie sintetica viene introdotto al corpo. Essa è caratterizzata da adsorbimento di proteine ​​del sangue e la conseguente attaccamento e l'attivazione delle piastrine, monociti / macrofagi adesione, e gli eventi di segnalazione cellulare infiammatori, portando a complicazioni post-procedurali. L'Apparato Chandler Loop è un sistema sperimentale che permette ai ricercatori di studiare le interazioni molecolari e cellulari che si verificano quando grandi volumi di sangue sono perfusi su condotti polimerici. A tal fine, questo apparato è stato usato come modello ex vivo che consentano di valutare le proprietà anti-infiammatorie di varie modificazioni superficiali polimeriche. Il nostro laboratorio ha dimostrato che i condotti del sangue, covalentemente modificati via chimica fotoattivazione con CD47 ricombinante, possono conferire biocompatibilità alle superfici polimeriche. Aggiunta di CD47 alle superfici polimeriche potrebbe essere un mezzo efficace per promuovere l'efficacia dei condotti di sangue polimerici. Leiein è la metodologia in dettaglio la chimica fotoattivazione utilizzato per aggiungere CD47 ricombinante per clinicamente rilevanti condotti sanguigni polimerici e l'uso del Chandler Loop come modello sperimentale ex vivo per esaminare le interazioni di sangue con le CD47 modificato e controllo condotti.

Introduzione

Molte procedure cliniche, come bypass cardiopolmonare e dialisi renale, richiedono l'uso di condotti sangue polimerici e sono spesso associati a complicanze post-procedurali ^1. Quando perfusi con sangue, questi polimeri illeciti la reazione da corpo estraneo (FBR), con conseguente assorbimento di proteine ​​del sangue e piastrine, monociti / macrofagi adesione, e il rilascio di citochine pro-infiammatorie, tutti che contribuiscono complicanze post-procedurali e / o guasto del dispositivo ^2,3. Pertanto, le strategie per affrontare la questione rimane un settore importante e costante della ricerca biomateriali. Gli investigatori hanno cercato di affrontare questo problema modificando superfici sangue contatto con bioattivi o bioinerte molecole ^4-6. La ricerca nel nostro laboratorio si è concentrata sulla aggiungendo CD47 ricombinante (recCD47) per biomateriali polimerici come strategia per mitigare la FBR e aumentare l'efficacia di questi materiali. CD47 è una transmembr ubiquitariamente espressaane proteina con un ruolo conosciuto in evasione immune, riconoscere il carattere "self" su cellule che esprimono ^7-10 e mostra la promessa di conferire biocompatibilità quando aggiunto alle superfici polimeriche ^11-13. Signal-normativo proteina alfa (SIRPα), il recettore affine per CD47, e un membro del motivo inibitorio a base di tirosina immunoreceptor (ITIM) -contenenti famiglia di proteine ​​transmembrana, è espresso sulle cellule di origine mieloide ^14. Abbiamo precedentemente dimostrato che CD47, tramite segnalazione cellulare SIRPα-mediata, down-regola le risposte immunitarie a poliuretano (PU) e polivinilcloruro (PVC) in in vitro, ex vivo e in modelli in vivo ^11-13.

Centrale per le nostre indagini è una chimica fotoattivazione relativamente nuovo, qui descritto, in cui i gruppi tiolici chimicamente reattivi sono covalentemente aggiunti a tubo polimerico facendo reagire il tubo con un polimero multifunzionale (PDT-BzPh), composto da 2-pyridyldithio (PDT), il benzofenone fotoreattivo (BzPh) e un polyallylamine carbossi-modificata ^11-13. Ridurre i gruppi PDT covalentemente allegati con tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP) ¹¹ produce una superficie tiolati che può essere successivamente fatto reagire con porzioni terapeutiche. Particolareggiata in questa sede e in precedenza ^12,13, recCD47, ulteriormente modificato con l'aggiunta di una poli-lisina coda C-terminale ^12,13, viene fatto reagire con Sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cicloesano-1-carbossilato (solfo-SMCC) per 1 ora a generare gruppi tiolici-reattiva, consentendo una formazione di legami monosulfide tra il tubo e il recCD47 ^11. La capacità anti-infiammatoria delle superfici funzionalizzate CD47 è stato testato, ex viv o, utilizzando l'Apparato Chandler Loop con tutto il sangue umano, che è stato originariamente descritto nel 1958 come un modello in vitro della coagulazione trombotica ^15. L'apparato si basa su unSistema di tubo chiuso parzialmente riempito di aria e un motore rotativo per far circolare il sangue attraverso il tubo ^15. Questo modello sperimentale fornisce l'opportunità di esaminare l'effetto dell'esposizione sangue su superfici modificate e non modificate così come l'effetto di tali modificazioni superficiali sulla fisiologia delle cellule del sangue.

recCD47 può essere aggiunto a una varietà di superfici polimeriche utilizzando questa chimica fotoattivazione, e la sua capacità anti-infiammatoria può essere valutata utilizzando un modello clinicamente rilevante ex vivo imitando la perfusione di sangue sulle superfici polimeriche ^11,12. Grade clinici condotti sanguigni modificati con recCD47 mostrano molto meno piastrinica e l'adesione delle cellule infiammatorie rispetto a polimeri modificati se esposti a sangue umano nell'apparato. Una descrizione step-by-step di questo processo di modifica è descritto di seguito.

Protocollo

1. Modifica polimerici Superfici con recCD47

NOTA:. Il protocollo è riassunta schematicamente in Figura 1 Figura 1A illustra generazione di superfici polimeriche tiolo reattivo Figura 1B illustra generazione di tiolo reattivo recCD47..

1. Giorno 1
   1. Preparare una soluzione di PDT-BzPh (1 mg / ml) e bicarbonato di potassio (KHCO ₃₎ (0,7 mg / ml) in acqua sterile. Mescolare notte a 4 ° C (riparo dalla luce).
2. Giorno 2
   1. Tagliare il tubo polimerico a 40 centimetri pezzi lunghi (abbastanza a lungo per adattarsi intorno ruote girevoli).
   2. Bagnare i tubi in una soluzione acquosa 0,1% di hexacylpyridinium per 90 minuti a temperatura ambiente su un agitatore o su Chandler Loop Apparecchiatura. Sciacquare le provette con 3x acqua sterile dopo l'90 min ammollo.
   3. Acidificare la soluzione di PDT-BzPh dal 1 ° giorno aggiungendo il 15% di potassio fosfato monobasico acquosa (KH ₂ PO _4). Aggiungere 50 ml KH ₂ PO ₄ per ml di PDT-BzPh, formando una soluzione micellare nuvoloso.
   4. Bagnare i tubi nella soluzione PDT-BzPh acidificato per 40 minuti a temperatura ambiente su un agitatore o apparato.
   5. Sciacquare le provette con acido acetico diluito (1: 1.000) una volta.
   6. Esporre i tubi per irradiazione UV per una durata complessiva di 60 min. Ruotare i tubi ¼ di giro ogni 15 minuti per irradiare l'intera superficie.
   7. Bagnare i tubi in una soluzione di bicarbonato di potassio / ml 20 mg (KHCO ₃₎ per 20 minuti a temperatura ambiente su un agitatore o apparato.
   8. Sciacquare le provette con 3x acqua sterile e conservare a 4 ° C in acqua sterile.
3. Giorno 3
   1. Disciogliere 5 mg solfo-SMCC in 200 microlitri dimetilformammide (DMF) (Attenzione: Eseguire in cappa).
   2. Aggiungere 50 ml della soluzione di solfo-SMCC preparata al punto 1 a 0,1 mg / ml di soluzione di poli-lisina recCD47, e mescolare per 60 min a rotemperatura om.
   3. Durante 60 min mescolare, degas sterilizzato Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) e mettere da parte.
   4. Purificare solfo-SMCC reagito recCD47 utilizzando un 7K peso molecolare di cut-off di spin dissalazione colonna secondo le istruzioni del produttore. Raccogliere finale a flusso continuo (alta qualità tiolo reattivo recCD47) e portare a volume necessario per rivestire l'interno del tubo con DPBS.
   5. Sciacquare i tubi dal giorno 2 con sterile, degassata DPBS 3x.
   6. React superficie modificata dei tubi con una soluzione di 20 mg / ml di tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP) in DPBS degassati per meno di 2 min. Sciacquare le provette con sterili degassificato DPBS 4x.
   7. Aggiungere il recCD47 Sulfo-SMCC-reagito ai tubi e incubare una notte a 4 ° C su un agitatore o apparati.

2 Immunoassay Quantificazione dei recCD47 su superfici modificate

1. Sciacquare i tubi modificati per essere quantificato dal Day 3 with DPBS 3x. Conservare le provette non utilizzate per la quantificazione in DPBS a 4 ° C.
2. Utilizzare una biopsia 4 mm e fare i campioni del tubo duplicati e inserire pugni biopsia in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
3. Preparare un controllo negativo costituito da un tubo campione non modificato non trattato con l'anticorpo di rilevazione. Preparare un controllo dell'anticorpo costituito da un tubo campione non modificato trattati con l'anticorpo di rilevamento. Preparare i campioni di prova dei tubi modificati trattati con l'anticorpo di rilevazione.
4. Campioni di blocco con albumina sierica bovina 0,4% (BSA) in DPBS per 60 minuti a temperatura ambiente su un agitatore.
5. Dopo il blocco, aspirare BSA e sciacquare con tris-buffered saline più l'1% Tween-20 (TBST) 3x, 10 minuti ciascuna su un agitatore.
6. Preparare una diluizione di lavoro degli anticorpi nel 0,4% di BSA secondo la diluizione raccomandata dal produttore per saggi immunologici. Diluire CD47 anticorpi umani B6H12-FITC 1: 100 in 0,4% di BSA.
7. Aggiungere 200 ml di diluizione anticorpo per pozzetti. Incubate controlli negativi con il 0,4% solo BSA. Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti su un agitatore (riparo dalla luce).
8. Risciacquare con TBST 3x, 10 minuti ciascuna su un agitatore. Aspirare l'ultimo risciacquo TBST e aggiungere 200 microlitri di DPBS pozzetti del campione del tubo.
9. Raccogliere il flow-through finale, che è di alta qualità tiolo-reattiva CD47 ricombinante e portare a un volume necessario per rivestire l'interno dei tubi con DPBS.
10. Leggi intensità del segnale FITC utilizzando un lettore di micropiastre con FITC di eccitazione (485 nm) e di emissione impostazioni (538 nm).
11. Calcola recCD47 destinato a superficie polimerica sulla base di valori standard, che rappresentano per auto-fluorescenza e non specifico vincolante dal campione di controllo dell'anticorpo.

3. Chandler Loop Apparato protocollo

Cercate Institutional Review Board (IRB) approvazione del protocollo di raccolta del sangue e informato consenso scartoffie prima di iniziare la raccolta dei campioni di sangue umano. Ottenere informazionirmed consenso da un donatore di sangue umano.
NOTA: Un diagramma raffigurante l'apparato è mostrato nella Figura 2.

1. Riempire bagnomaria con acqua distillata fino a circa mezzo delle ruote di diametro sono sommerso. Aggiungere abbastanza candeggina al bagnomaria per ottenere una soluzione di candeggina al 10%. Set bagno d'acqua a 37 ° C e che la temperatura equilibrare.
2. Raccogliere adattatori in metallo (indicati nella Figura 1B), tubi senza modifiche e tubi modificati, e assemblare attorno alle ruote apparecchi, come mostrato nella Figura 1C. Assicurarsi che il tubo si adatta snuggly intorno alla ruota con l'adattatore in metallo posto.
3. Ottenere 30 ml di campione di sangue usando un protocollo IRB-approvato, in un flaconcino preriempita con 2 ml di citrato o altro anticoagulante, e mescolare per inversione per prevenire la coagulazione una volta che il campione è stato raccolto.
4. Aggiungere circa 10 ml di sangue per ciascun tubo con la valvola di metallo e la siringa, lasciando un po 'd'aria nel tubo. Fissare il tappo della valvola e rotate per 3 ore.
5. Drenare il sangue in un bicchiere reflue trattate con una soluzione di candeggina al 10% (o come richiesto dalla politica istituzionale).
6. Lavare delicatamente il tubo interno con DPBS per rimuovere tutte le tracce di sangue. Raccogliere flusso continuo nel becher rifiuti. Smaltire sangue in conformità con la politica istituzionale.
7. Disinfettare l'apparato e il sangue di contattare superfici utilizzando una soluzione di candeggina al 10% o in base alla politica istituzionale.
8. Campioni di processo per microscopia a fluorescenza o la scansione microscopia elettronica come descritto di seguito.

4. fluorescente Microscopia e conteggio delle cellule

1. Preparare una soluzione al 4% paraformaldeide (PFA) (Attenzione: Eseguire in cappa).
2. Incubare il tubo in una soluzione PFA 4% per una notte a 4 ° C.
3. Dopo incubazione overnight, rimuovere 4% PFA e risciacquare film molto delicatamente con DPBS.
4. Tagliare il tubo in sezioni per esporre la superficie del lume per la colorazione.
5. Stainuna sezione del tubo con alcune gocce di mezzo di montaggio con 4 ', 6-diamino-2-fenilindolo (DAPI) per 30 minuti a temperatura ambiente (proteggere dalla luce). Dopo la colorazione, sciacquare il tubo molto delicatamente con DPBS per ridurre il segnale DAPI sfondo.
6. Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un filtro DAPI e fotocamera digitale per contare il numero di cellule in 9 settori ciecamente selezionati di vista sotto 200 ingrandimenti.
7. Cella Record conta per campo visivo ed eseguire appropriate analisi statistiche per determinare la significatività statistica dei risultati.

5. Microscopia Elettronica a Scansione

1. Preparare una soluzione di glutaraldeide al 2% (Attenzione: Eseguire in cappa).
2. Incubare il tubo in una soluzione di glutaraldeide al 2% notte a 4 ° C.
3. Dopo incubazione overnight, lavare delicatamente la 3x tubi con DPBS.
4. Preparare una soluzione all'1% di tetrossido di osmio (Attenzione: pericolo di inalazione grave! Utilizzare in cappa).
5. Incubare il tubo in una soluzione all'1% di tetrossido di osmio per 15 min a temperatura ambiente.
6. Lavare delicatamente il tubo 3x con DPBS.
7. Preparare una serie di concentrazioni di etanolo (25%, 50%, 75%, 95% e 100% etanolo).
8. Disidratare il tubo mediante incubazione nella serie di concentrazioni di etanolo. Incubare a 25%, 50%, 75% e 95% di etanolo per 20 minuti ciascuno. Incubare a 100% di etanolo per 30 min.
9. Punto supercritico asciugare il tubo con CO ₂ per 45 minuti per rimuovere tutta l'umidità.
10. Sezioni del tubo Montare su un stub campione con pasta d'argento o grafite.
11. Sezioni del tubo cappotto con 12,5 nm di oro-palladio.
12. Esaminate in un microscopio elettronico a scansione.

Risultati

Generazione di superfici polimeriche tiolo reattivo attraverso l'uso di PDT-BzPh e TCEP insieme tiolo reattivo recCD47 poli-lisina utilizzando SMCC permette il fissaggio di recCD47 a superfici polimeriche. Il processo di modifica è riassunta schematicamente in figura 1. La comodità di questo processo di modifica è che può essere applicato a molte proteine ​​differenti e molteplici superfici polimeriche, assumendo la proteina può essere modificato con sufficienti gruppi chimicamente reattivi...

Discussione

La chimica fotoattivazione (riassunto nella Figura 1) consente la modifica di qualsiasi superficie polimerica che ha idrocarburi sufficienti per facilitare il fissaggio PDT-BzPh e la successiva irradiazione UV per foto-attivare il PDT-BzPh. Funzionalizzare la superficie polimerica con gruppi tiolici reattivi consente la successiva collocazione di una serie di molecole di interesse testabili. Nei nostri studi particolari abbiamo scelto ricombinante CD47 ^11-13. La particolare coniugazione chimi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891